人巨细胞病毒IE1蛋白、WD重复蛋白5在高级别胶质瘤中的表达及意义

目的探讨人巨细胞病毒IE1蛋白(HCMV-IE1)及WD重复蛋白5(WDR5)在高级别胶质瘤中的表达及意义。方法采用免疫组织化学(免疫组化)方法检测HCMV-IE1和WDR5在60份高级别胶质瘤组织及20份正常脑组织中的表达,分析HCMV感染与WDR5的相关性及两者对胶质瘤预后的影响。结果 53份(88.3%)高级别胶质瘤组织中的HCMV-IE1呈阳性表达,20份正常脑组织中均无HCMV-IE1表达(P <0.001);HCMV-IE1表达程度低者总生存率优于表达程度高者(P=0.037)。49份(81.6%)高级别胶质瘤组织中WDR5表达阳性,11份(5.5%)正常脑组织中WDR5表达阳性(P=0.009)。在60份高级别胶质瘤组织中,HCMVIE1与WDR5同时高表达有27例(45.0%),同时低表达有14例(23.3%),HCMV-IE1表达与WDR5表达呈正相关(r=0.336,P=0.009)。结论 HCMV-IE1与高级别胶质瘤发生发展相关,是判断高级别胶质瘤预后的指标,其机制可能与HCMV-IE1和WDR5呈正相关有关联。

WD重复域蛋白5在宫颈癌组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系

目的探讨WD重复域蛋白5(WD repeat-containing protein 5,WDR5)蛋白在宫颈癌(cervical cancer,CA)组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系。方法纳入2018年1月至2020年3月山东第一医科大学附属人民医院接收的CA患者(105例)为研究对象,收集患者的癌组织及癌旁组织标本,采用免疫组织化学染色法及Western blot法检测CA组织及癌旁组织中WDR5水平采用免疫组化以及Western blot法测定;生存分析采用Kaplan-Meier法;患者预后影响因素通过Cox回归进行分析。结果105例CA组织标本中,WDR5的阳性表达率(WDR5阳性例数/癌组织总例数)为68.57%(72/105)高于癌旁组织22.86%(24/105)(P<0.05);相较于癌旁组织(1.00±0.11),WDR5的表达量在CA组织(4.66±0.98)中较高(t=38.030,P<0.05);WDR5表达量与分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05);WDR5阳性表达的生存率65.28%(47/72)低于阴性表达90.91%(30/33)(Log rankχ2=6.732,P=0.009);TNM分期、WDR5、分化程度、淋巴结转移均是患者预后的影响因素(P<0.05)。结论WDR5表达在CA患者癌组织中升高,其水平变化与CA患者TNM分期、分化程度、淋巴结转移及预后密切相关。

WD40重复蛋白43在肺腺癌中的表达及其对细胞紫杉醇耐药的影响

目的·分析WD40重复蛋白43 (WD 40 repeat protein 43, WDR43) mRNA在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)细胞中的表达及其与LUAD患者预后的相关性,并探讨WDR43对LUAD细胞发生紫杉醇耐药的影响。方法·通过癌症治疗反应门户网站(Cancer Therapeutics Response Portal,CTRP),下载LUAD细胞的紫杉醇敏感性与其基因表达的相关性系数,筛选紫杉醇耐药相关基因,行基因本体数据库(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)通路分析,并以相关基因WDR43作为研究对象行后续分析及验证。检索人类蛋白图谱(Human Protein Atlas,HPA)数据库,分析WDR43蛋白在LUAD组织中的表达和定位。检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,分析WDR43 mRNA在LUAD组织和正常肺组织中的表达差异、LUAD患者的WDR43突变情况以及WDR43 mRNA与不同临床病理因素的相关性。检索CaArray数据库,分析WDR43 mRNA与LUAD患者预后之间的相关性。检索肿瘤浸润性免疫细胞分析(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)数据库,分析WDR43表达与LUAD组织中免疫细胞浸润水平的相关性。通过癌症细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE)数据库比较不同LUAD细胞中WDR43基因表达,构建差异表达WDR43的LUAD细胞,并采用MTT实验和平板克隆形成实验验证WDR43表达对紫杉醇耐药性的影响。结果·通过CTRP筛选出了LUAD细胞紫杉醇敏感性相关基因WDR43。GO功能分析和KEGG通路分析的结果显示,WDR43等基因与rRNA合成、细胞形态调控等相关,且主要富集在单纯疱疹病毒1感染信号通路和胞浆DNA感受器信号通路。HPA数据库的分析结果显示,WDR43蛋白主要表达于LUAD细胞的细胞核、细胞质及细胞膜中。TCGA数据库的分析结果显示,WDR43 mRNA在LUAD组织中的表达明显高于正常肺组织(P=0.000),在LUAD吸烟患者的癌组织中的表达明显高于非吸烟者(P=0.000),在TP53突变型患者中的表达亦高于TP53野生型患者(P=0.000)。CaArray数据库的分析结果显示,WDR43 mRNA高表达的LUAD患者的预后较差(均P=0.000)。TIMER数据库的分析结果显示,WDR43表达可促进LUAD组织中的中性粒细胞、CD8^(+)T细胞、骨髓来源的抑制性细胞、巨噬细胞的浸润,抑制CD4^(+)T细胞的浸润。体外实验证实,过表达WDR43可增强LUAD细胞对紫杉醇的耐药能力。结论·WDR43在LUAD组织中的表达显著增加且与患者预后呈负相关,WDR43的过表达可增强LUAD细胞的紫杉醇耐药能力。

WD重复结构域相关蛋白3对胃恶性肿瘤细胞增殖的影响

目的探讨外源性基因WD重复结构域相关蛋白3(RFWD3)对胃恶性肿瘤细胞增殖的影响。方法通过癌症基因组图谱(TCGA)数据库选出目的基因,实验分为shCtrl组和shRFWD3组,采用逆转录-聚合酶联反应(RT-PCR)检测该基因在胃癌细胞株中的表达,构建慢病毒载体,慢病毒感染胃癌细胞,通过RT-PCR检测mRNA水平目的基因的敲减率,使用Celigo仪器检测细胞增殖,采用比色法(MTT)检测RFWD3对目的细胞增殖的影响。结果通过TCGA数据库及统计分析,筛选出目的基因RFWD3。RT-PCR检测结果显示,该基因在胃腺癌细胞AGS中呈高表达(P<0.05)。慢病毒感染细胞后,shRFWD3组细胞感染效率达到80%以上。RT-PCR检测结果显示,胃腺癌细胞AGS中RFWD3基因在mRNA水平的表达量受到抑制(P<0.05),敲减率达50.7%。Celigo仪检测结果显示,经shRNA慢病毒感染AGS细胞72 h后,与shCtrl组比较,shRFWD3组细胞的增殖速率受到明显抑制(P<0.05)。结论干扰目的基因RFWD3具有抑制胃腺癌细胞AGS增殖的作用,RFWD3基因可能成为胃癌临床治疗的潜在靶点。

p62体募集自噬相关蛋白WIPI2的机制研究

目的探讨自噬接头蛋白(Sequestosome 1,SQSTM1/p62)与磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)复合物的结合蛋白WD重复结构域磷酸肌醇互作蛋白2(WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 2,WIPI2)在空间上定位的调控关系。方法使用CRISPR-Cas9技术敲除正常大鼠肾上皮细胞(Normal rat kidney,NRK)中的自噬相关基因2A(Autophagy-related gene,Atg2A)、自噬相关基因2B(Autophagy-related gene,Atg2B)和p62基因,建立Atg2A和Atg2B基因敲除的细胞系(Atg2AB double knockout,Atg2AB DKO)以及p62基因敲除细胞系(p62 knockout,p62 KO);透射电镜观察Atg2AB DKO细胞中p62体周围囊泡的定位;活细胞成像观察Atg2AB DKO细胞内p62体与自噬相关蛋白WIPI2的定位变化;光漂白实验观察相变蛋白p62与WIPI2的荧光漂白恢复;通过免疫荧光观察WT、p62 KO和Atg2AB DKO细胞中WIPI2与p62的定位关系;通过蛋白免疫印记检测WT和p62 KO细胞中WIPI2表达量的变化。结果建立了Atg2AB DKO和p62 KO细胞系;透射电镜显示Atg2AB DKO细胞中p62附近聚集了大量囊泡;在Atg2AB DKO中,通过活细胞成像观察到tdTomatop62与WIPI2-GFP高度共定位;荧光漂白实验观察到WIPI2具有流动性;通过免疫荧光观察到,与WT细胞相比,在Atg2AB DKO中WIPI2点的数量明显增多(P<0.0001);与WT细胞相比,p62 KO细胞中WIPI2点的数量和表达量无明显变化(P>0.05)。结论无膜细胞器p62能够与具有流动性的WIPI2阳性囊泡动态融合,促进自噬体的形成。

敲低WDHD1对鼻咽癌细胞增殖、铜含量及铜死亡相关因子的影响

目的探讨敲低WD重复序列和HMG框DNA结合蛋白1(WDHD1)对鼻咽癌细胞增殖、铜含量及铜死亡相关因子的影响。方法将鼻咽癌细胞(HK-1细胞和HONE-1细胞)分别分为对照组、敲低空载组(sh-NC组)、WDHD1敲低组(sh-WDHD1组)。对照组不做处理,sh-NC组、sh-WDHD1组分别转染阴性对照慢病毒、sh-WDHD1 RNA慢病毒。转染成功后,检测各组HK-1细胞和HONE-1细胞增殖活性、铜含量、铜死亡相关基因m RNA及蛋白表达情况;将sh-WDHD1组的HK-1细胞和HONE-1细胞分为sh-WDHD1对照组、sh-WDHD1/DMSO组、sh-WDHD1/ATTM组,分别使用完全培养基、含DMSO的完全培养基、含铜螯合剂ATTM的完全培养基进行培养,然后检测细胞铜含量。结果(1)与对照组和sh-NC组相比,sh-WDHD1组HONE-1细胞在24 h、48 h的增殖活力下降,HK-1细胞在48 h的增殖活力下降(P<0.05)。(2)在HONE-1细胞和HK-1细胞中,与对照组及sh-NC组相比,sh-WDHD1组的细胞铜含量增加,金属调节转录因子1(MTF1)的mRNA表达水平、硫辛酸合成酶(LIAS)的mRNA和蛋白表达水平增高,而血管内皮生长因子受体A(VEGFA)的mRNA表达水平、肿瘤蛋白p53(TP53)的mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。(3)与sh-WDHD1对照组及sh-WDHD1/DMSO组相比,sh-WDHD1/ATTM组HONE-1细胞和HK-1细胞的铜含量下降,HONE-1细胞在48 h的增殖活力增强,HK-1细胞在24 h、48 h的增殖活力增强(P<0.05)。结论敲低WDHD1可降低鼻咽癌细胞的增殖活性,增加细胞内铜含量蓄积,上调铜死亡促进因子LIAS、MTF1的表达,下调铜转运关键因子VEGFA及铜代谢关键因子TP53的表达。TP53和LIAS可能在WDHD1影响鼻咽癌细胞的铜蓄积和铜死亡进程中发挥重要作用。

转甲状腺素蛋白介导STAT4/miR-223-3p/FBXW7通路对高糖诱导的人视网膜内皮细胞新生血管生成的影响

目的分析转甲状腺素蛋白(TTR)介导信号转导和转录激活因子4(STAT4)/miR-223-3p/F-box WD重复蛋白7(FBXW7)通路对高糖(HG)诱导的人视网膜内皮细胞(hRECs)新生血管生成的影响。方法将hRECs分为对照组、HG组、HG+TTR组、HG+NC mimic组、HG+miR-223-3p mimic组和HG+TTR+miR-223-3p mimic组。生物信息学分析STAT4与miR-223-3p的靶向关系,并采用双荧光素酶报告实验进行验证。ELISA检测细胞中TTR水平,RT-PCR检测miR-223-3p水平,CCK-8法检测细胞增殖,血管生成实验分析血管生成率,Western blot检测血管内皮生长因子(VEGF)、TTR、STAT4和FBXW7蛋白表达。结果与对照组相比,HG组hRECs中TTR水平升高(P<0.05)。培养24 h时,与HG组相比,HG+TTR组细胞活力明显下降(P<0.05)。与HG组血管生成率(38.12±4.91)%相比,HG+TTR组hRECs血管生成率[(19.46±2.12)%]明显较小(P<0.05)。与HG+NC mimic组相比,HG+miR-223-3p mimic组hRECs中miR-223-3p表达上调,细胞活力增加(均为P<0.05);与HG+miR-223-3p mimic组相比,HG+TTR+miR-223-3p mimic组hRECs中miR-223-3p表达下调,细胞活力下降(均为P<0.05)。与HG+NC mimic组血管生成率(40.11±4.10)%相比,HG+miR-223-3p mimic组hRECs血管生成率[(61.52±6.25)%]增多(P<0.05);与HG+miR-223-3p mimic组相比,HG+TTR+miR-223-3p mimic组hRECs血管生成率[(42.24±4.33)%]减少(P<0.05),且与HG+NC mimic组比较差异无统计学意义(P>0.05)。生物信息学分析结果显示,STAT4与miR-223-3p启动子区域相互作用。与HG组相比,HG+TTR组hRECs中miR-223-3p、STAT4蛋白表达均降低,FBXW7和VEGF蛋白表达均升高(均为P<0.05);与HG+TTR组相比,HG+miR-223-3p mimic组hRECs中miR-223-3p、STAT4蛋白表达均升高,FBXW7和VEGF蛋白表达均降低(均为P<0.05);与HG+miR-223-3p mimic组相比,HG+TTR+miR-223-3p mimic组hRECs中miR-223-3p、STAT4蛋白表达均降低,FBXW7和VEGF蛋白表达均升高(均为P<0.05);与HG+TTR组相比,HG+TTR+miR-223-3p mimic组hRECs中miR-223-3p、VEGF、STAT4和FBXW7蛋白表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论TTR可能通过调节STAT4/miR-223-3p/FBXW7通路抑制HG诱导的hRECs的血管生成。

β螺旋蛋白相关性神经变性病的研究进展

β螺旋蛋白相关性神经变性病(β-propeller protein-associated neurodegeneration,BPAN)是一种由WD重复蛋白45(WD repeatcontaining protein 45,WDR45)基因突变引起的X连锁显性遗传性疾病,具有高度临床异质性和遗传异质性。该病具有双相临床进程,儿童期和青春期或成年早期2个阶段临床表现不同。主要表现为儿童期全面发育迟滞伴癫痫发作,青春期或成年早期出现肌张力障碍、帕金森综合征和认知功能障碍,导致严重残疾。儿童期症状通常在青春期和成年早期有所改善。头颅影像学显示苍白球和黑质存在异常铁沉积。该文对BPAN临床特点和分子遗传学研究进展作一综述。

表达人WDR70基因的质粒构建及鉴定

WD重复蛋白(WD repeat protein)家族是一类含有多个保守WD基序的蛋白.该家族蛋白广泛存在于真核细胞中,参与细胞发育、增殖和凋亡等生理过程.WDR70隶属于WD重复蛋白家族,其生物学功能目前仍不清楚.本文以人cDNA为模板扩增WDR70基因;然后以pTag2b为载体,通过同源重组构建重组质粒并进行测序.同时将质粒转染至人肺癌细胞株A549中,进行WDR70蛋白的表达分析.结果显示该重组质粒在A549细胞中能有效表达.质粒pTag2B-WDR70的成功构建为进一步研究WDR70相关生物学功能提供实验基础.

凡纳滨对虾WDS基因克隆及其表达分析

【目的】分析WDS基因在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)各组织中的表达情况及应对不同病原感染时的表达变化,以揭示WDS在动物体除生殖外其他生理活动中的功能作用。【方法】采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾WDS基因(LvWDS)cDNA序列,利用在线生物信息学软件进行序列分析,并以实时荧光定量PCR分析LvWDS基因在凡纳滨对虾不同组织中的表达情况及不同病原感染后的表达变化。【结果】LvWDS基因(GenBank登录号MH330316)c DNA序列全长1880 bp,其中,开放阅读框(ORF)978 bp,5'端非编码区(5'UTR)183 bp,3'端非编码区(3'UTR)719 bp,编码325个氨基酸。LvWDS氨基酸序列含有7个WD40重复序列(保守结构域),与拟穴青蟹(Scylla paramamosain)WDS氨基酸序列的相似性最高,为99%,基于WDS氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示LvWDS与拟穴青蟹WDS的亲缘关系最近。LvWDS基因在凡纳滨对虾精囊中的相对表达量最高,在血细胞、鳃和肠道等免疫组织中处于较高表达水平,在肌肉组织中的表达水平最低。经白斑综合症病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染后,凡纳滨对虾血细胞、鳃和肠道组织中LvWDS基因的相对表达量均不同程度发生变化。【结论】WDS进化十分保守,其在不同物种中的功能稳定。LvWDS除了在凡纳滨对虾生殖发育中发挥重要作用外,可能还与免疫相关,在凡纳滨对虾抗病免疫中发挥作用。

紫色番茄SlWD40-like基因克隆与表达分析

WD-重复蛋白(WD-repeat protein)是一类含有WD40基序的蛋白,在植物响应非生物逆境胁迫的过程中具有重要调控作用。为揭示紫色番茄中WD40重复蛋白的功能,从富含花青素紫色番茄品种‘砚紫1号’中克隆 SlWD40-like基因,并对该基因在不同组织部位和不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明, SlWD40-like基因编码1个含有460个氨基酸的蛋白质。蛋白序列分析显示,SlWD40-like蛋白含有6个WD40基序,是典型的WD40重复蛋白。预测分析发现,该蛋白为亲水性蛋白,其二级结构以无规则卷曲为主;该蛋白序列在物种间具有高度的保守性,系统发生进化树分析表明紫番茄SlWD40-like氨基酸序列与潘那利番茄蛋白亲缘关系最近,其次是胡萝卜。应用qRT-PCR分析 SlWD40-like基因组织特异表达发现,该基因在叶和紫色果实中表达量最高。qRT-PCR分析表明, SlWD40-like基因受到盐胁迫、干旱胁迫脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导表达,推测该基因可能参与紫色番茄逆境胁迫应答。该研究为后续进一步分析紫色番茄 SlWD40-like基因功能奠定了基础。

RFWD3在肝细胞癌中的表达及其临床相关性研究

目的探索HCC临床标本中环指和WD重复结构域相关蛋白3(ring finger and WD repeat domain 3,RFWD3)的表达情况,并结合临床资料分析其与HCC预后的相关性。方法采用RT-PCR、Western blotting和免疫组化(IHC)法检测40例HCC患者癌组织及癌旁正常肝脏组织中RFWD3的mRNA及蛋白表达量,并运用GEPIA数据库分析RFWD3的表达和生存情况作为补充验证,同时结合临床资料分析其与HCC预后之间的相关性。结果RT-PCR、Western blotting和IHC检测发现,与癌旁组织相比,HCC组织中RFWD3的表达显著升高(P<0.05)。临床资料分析发现,RFWD3的高表达与HCC肿瘤大小显著相关(P<0.05)。生存分析发现,RFWD3高表达的HCC患者拥有更低的总体生存率和无瘤生存期(P<0.05)。结论RFWD3基因的高表达参与了HCC的发生和发展,可能是HCC一个重要的不良预后因素。

WDR5在肺腺癌中的表达和预后提示作用研究

目的分析WD重复域蛋白5(WDR5)表达与肺腺癌发生、发展的关系,探讨WDR5在评估远期生存中的价值。方法选取2010年1月1日至2014年2月8日于杭州市第三人民医院胸外科就诊且术后病理检查结果证实为肺腺癌的患者93例,采用免疫组织化学染色法分别检测WDR5在癌和癌旁正常组织中的表达水平。采用Cox比例风险回归模型对患者的生存情况作单因素、多因素分析,采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用log-rank检验比较WDR5高表达与低表达患者1、3及5年生存率。结果53例(57.0%)患者肺腺癌组织中WDR5相对高表达,40例(43.0%)WDR5相对低表达;在其对应的癌旁正常组织中,30例(32.3%)WDR5相对高表达,63例(67.7%)WDR5相对低表达,与癌组织比较差异有统计学意义(P<0.01)。WDR5的表达与患者的性别、年龄、肿瘤直径、T分期、病理分级均无关(均P>0.05);但与N分期和肿瘤分期均相关(均P<0.01)。单因素分析显示,WDR5表达、N分期和肿瘤分期均是肺腺癌患者预后的影响因素(均P<0.01);进一步多因素分析显示,WDR5表达和N分期是肺腺癌患者预后的独立影响因素(均P<0.01)。WDR5高表达患者的1、3及5年生存率分别为86.8%、41.5%和9.4%;WDR5低表达患者的1、3及5年生存率分别为95.0%、80.0%和55.0%,两者比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论WDR5在肺腺癌组织中的表达水平高于癌旁正常肺组织。WDR5高表达与N分期和肿瘤分期相关,且WDR5高表达患者总生存期更短,是肺腺癌预后的独立影响因素。

BRWD3对乳腺癌淋巴结转移的影响

目的探讨溴结构域和WD重复蛋白3(BRWD3)对乳腺癌淋巴结转移的影响及其作用机制。方法采用体外细胞侵袭实验探究BRWD3对乳腺癌细胞系侵袭能力的调控作用。采用裸鼠淋巴结转移和肺转移模型探究BRWD3对裸鼠乳腺癌淋巴结转移和肺转移的调控作用。通过cBioPortal数据库检索BRWD3共表达基因,进行生物功能及通路的聚类分析,构建BRWD3分子调控网络,并用Western blotting进行部分验证。采用公共数据库数据和KMPLOT平台分析BRWD3在乳腺癌中的表达情况及其与乳腺癌预后的关系。结果体外实验结果显示,敲除BRWD3促进了乳腺癌细胞系的侵袭(P<0.01)和迁移,但未促进乳腺癌细胞增殖。裸鼠淋巴结转移模型显示,敲除BRWD3能够明显促进乳腺癌淋巴结转移;肺转移模型显示,BRWD3未影响乳腺癌的肺转移能力。GO功能分析显示,BRWD3共表达基因主要富集于基因表达调控、DNA损伤修复、染色体的组织与修饰、蛋白质泛素化等生物学功能。KEGG富集分析显示,BRWD3共表达基因主要参与蛋白质泛素化、氧化磷酸化、MAPK等信号通路。Western blotting检测证实,敲除BRWD3促进了ERK1/2的磷酸化。BRWD3在发生淋巴结转移乳腺癌患者中的表达量明显低于未发生淋巴结转移的患者。KMPLOT分析结果显示,BRWD3低表达患者的预后较差,其生存期明显短于BRWD3高表达患者。结论 BRWD3能够调控乳腺癌的侵袭和体内淋巴结转移,BRWD3低表达患者预后较差。BRWD3可能亦具有调控蛋白质泛素化、氧化磷酸化、MAPK通路等功能。该发现为乳腺癌淋巴结转移相关分子标志物的研究和应用提供了新的理论基础。

非肌层浸润膀胱癌患者癌组织BLACAT2、WDR5表达观察及预后影响因素分析

目的观察非肌层浸润膀胱癌(NMIBC)患者癌组织长链非编码RNA膀胱癌相关转录本2(BLACAT2)、WD重复域蛋白5(WDR5)的表达变化,并分析患者预后的影响因素。方法选取NMIBC组织及正常膀胱黏膜组织各94例份,采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测上述组织BLACAT2、WDR5 mRNA,免疫组化法检测上述组织WDR5蛋白,分析BLACAT2 mRNA、WDR5 mRNA之间及其与NMIBC临床病理特征的关系,比较不同BLACAT2、WDR5 mRNA表达的NMIBC患者总体无进展生存率,分析NMIBC患者的预后影响因素。结果NMIBC组织BLACAT2、WDR5 mRNA相对表达量分别为2.19±0.38、1.62±0.41,正常膀胱黏膜组织分别为0.47±0.09、0.61±0.12,两者比较,P均<0.05。NMIBC、正常膀胱黏膜组织WDR5蛋白阳性率分别为71.28%、10.64%,P<0.05。NMIBC组织BLACAT2 mRNA与WDR5 mRNA表达呈显著正相关(r=0.756,P=0.000)。BLACAT2、WDR5 mRNA表达与NMIBC肿瘤分期、病理分级有关(P均<0.05)。BLACAT2高表达者、低表达者3年总体无进展生存率分别为44.00%(22/50)、77.27%(34/44),WDR5 mRNA高表达者、低表达者3年总体无进展生存率分别为41.67%(20/48)、78.26%(36/46),两者比较,P均<0.05。肿瘤分期T1期、肿瘤分级高级别、BLACAT2高表达、WDR5 mRNA高表达是影响NMIBC患者无进展生存预后的独立危险因素。结论NMIBC组织BLACAT2、WDR5表达升高,与肿瘤分期、病理分级及无进展生存预后有关,肿瘤分期T1期、肿瘤分级高级别、BLACAT2高表达、WDR5 mRNA高表达是影响NMIBC患者无进展生存预后的独立危险因素。

FBXW7/MCM7信号轴介导肝癌细胞增殖的研究

目的 探讨FBXW7靶向调控MCM7表达对肝癌细胞增殖的影响。方法 采用免疫共沉淀法(CoIP)和免疫荧光染色法(IF),分析肝癌细胞系MHCC-97H中FBXW7与MCM7的互作关系;通过慢病毒感染过表达FBXW7和(或) MCM7,小干扰RNA技术下调FBXW7和(或) MCM7的表达;采用Western blot检测FBXW7对MCM7蛋白表达的影响,CCK-8实验检测肝癌细胞的增殖活性,EdU细胞增殖检测分析肝癌细胞的增殖能力,平板克隆实验分析肝癌细胞的集落形成能力。结果 在MHCC-97H细胞中,FBXW7与MCM7存在互作关系:过表达FBXW7抑制了MCM7的蛋白表达水平、并抑制了肝癌MHCC-97H细胞的增殖(P <0.05),在过表达FBXW7的基础上增加MCM7的表达后,细胞增殖能力提高(P <0.05);下调FBXW7后细胞中MCM7表达增加、细胞增殖能力增强(P <0.05),而下调FBXW7的同时干扰MCM7表达后,细胞增殖能力减弱(P <0.05)。结论 FBXW7能抑制肝癌细胞增殖,其机制与负向调节肝癌细胞中促癌蛋白MCM7的表达水平有关。

FBXW7在糖尿病心肌病中的表达

目的:检测含F框/WD重复域蛋白7(FBXW7)在1型糖尿病大鼠心肌中的表达,探究其在糖尿病心肌病发生发展中的作用。方法:实验将大鼠分为非糖尿病组(ND组)及糖尿病4、8和12周模型组(DM组),采用链脲佐菌素(60 mg/kg)一次性腹腔注射建立1型糖尿病大鼠模型。HE染色法观察心肌病理结构变化,Western blot和免疫组化法检测心肌中FBXW7蛋白的表达变化。结果:显微镜下可见糖尿病组大鼠心肌局灶性心肌细胞变性、坏死。Western blot和免疫组化结果均显示,4周、8周及12周DM组大鼠心肌中的FBXW7表达相对于ND组显著增加(P <0. 01),但是相比于4周和8周DM组,12周DM组大鼠心肌中的FBXW7表达相对下降(P <0. 05)。结论:随着糖尿病病程的延长,FBXW7在糖尿病心肌病大鼠心肌组织中的表达呈现先升高后降低的趋势,提示其在糖尿病心肌病发生发展中发挥了一定的作用。

RFWD3基因重组慢病毒表达载体的构建及RFWD3蛋白在宫颈癌细胞中的功能验证

目的构建E3泛素化连接酶环指与WD重复结构域蛋白(RING finger and WD repeat domain,RFWD3)的慢病毒表达载体,研究RFWD3对宫颈癌细胞增殖与迁移能力的影响。方法以宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板扩增RFWD3基因片段,利用DNA重组技术,将上述片段克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(简称pCDH)中,构建pCDH-RFWD3重组真核表达质粒。经酶切及测序验证准确后,采用三质粒慢病毒包装系统包装RFWD3病毒,通过梯度稀释法感染人胚肾上皮细胞(293T)检测病毒滴度。随后采用RFWD3慢病毒液感染宫颈癌HeLa细胞,运用Western blot实验检测慢病毒转导后HeLa细胞中RFWD3蛋白的表达水平,进一步通过CCK-8和细胞划痕实验检测过表达RFWD3蛋白对HeLa细胞增殖与迁移能力的影响。结果可表达RFWD3蛋白的pCDH-RFWD3慢病毒载体获成功构建。包装RFWD3慢病毒,建立稳定表达RFWD3蛋白的宫颈癌HeLa细胞系。RFWD3慢病毒转导后的HeLa细胞与对照细胞相比,其细胞增殖与迁移能力显著增强(P<0.05)。结论RFWD3能够显著增强宫颈癌HeLa细胞的增殖与迁移能力。

宫颈癌组织中FBW7和c-Myc的表达及相关性分析

目的:检测F盒/WD40重复域蛋白7(FBW7)和c-Myc在宫颈癌组织中的表达情况及临床意义,并分析两者表达的相关性。方法:收集我院2008年1月～2012年12月病理科存档的宫颈癌和正常宫颈组织标本70例,采用免疫组化SP法分别检测46例宫颈癌及24例正常宫颈组织中FBW7及cMyc的表达情况。结果:FBW7和c-Myc在宫颈癌组织中的阳性表达率分别为30.4%(14/46)和69.6%(32/46),在正常宫颈组织中的阳性表达率分别为66.7%(16/24)和25.0%(6/24),两组比较差异有统计学意义(χ2=8.454,P=0.004;χ2=12.622,P=0.000)。FBW7表达与宫颈癌临床分期(P=0.036)和病理学分级(P=0.023)显著相关,c-Myc表达与宫颈癌临床分期(P=0.036)、淋巴结转移(P=0.003)和病理学分级(P=0.003)也显著相关。宫颈癌组织中FBW7与c-Myc蛋白表达呈显著负相关(r=-0.667,χ2=6.694,P=0.010)。结论:宫颈癌组织中FBW7低表达,且与c-Myc表达呈负相关,提示FBW7可能通过调控c-Myc泛素化降解参与肿瘤发生、发展。

FBW7通过促进NOX1降解抑制ox-LDL诱导的颗粒细胞凋亡

目的:探讨含F框及WD重复结构域蛋白7(F-box and WD repeat domain containing protein 7,FBW7)对氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipopretion,ox-LDL)诱导的颗粒细胞(granulosa cells,GCs)损伤的影响,并分析其机制。方法:收集从不同肥胖程度育龄期女性分离的GCs、从高脂饮食(high-fatty diet,HFD)喂养大鼠分离的GCs及ox-LDL处理的大鼠GCs,用Western blot法检测FBW7的表达。用编码FBW7的腺病毒载体(Ad-FBW7)感染大鼠GCs后,再用ox-LDL(80 mg/L)处理细胞48 h,分别用CCK-8法、Annexin V/PI染色法、光泽精化学发光法和Western blot法检测细胞活力、细胞凋亡、NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)活性和NOX关键亚基的蛋白表达。用环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)追踪法评估过表达FBW7对NOX1降解的影响。结果:在肥胖育龄期女性的GCs、HFD喂养大鼠的GCs和ox-LDL处理的GCs中FBW7低表达(P<0.05)。过表达FBW7能抑制ox-LDL诱导的GCs损伤、NOX活性和NOX1表达(P<0.05)。CHX追踪法实验结果显示,在ox-LDL存在的条件下,过表达FBW7能加速NOX1的降解(P<0.05)。结论:过表达FBW7可通过加快NOX1降解而减弱NOX活性,从而减轻ox-LDL导致的GCs损伤。