珍珠粟WD40基因家族鉴定及表达特征分析

珍珠粟是世界范围重要的谷物,拥有极强的光合能力和高生产潜力,较其他作物相比,珍珠粟具有对贫瘠土壤的耐受性,能够适应多种非生物胁迫和多样化的环境条件。PgWD40基因家族在植物抵御生物和非生物胁迫以及调控植物生长发育中扮演着重要角色。本研究利用生物信息学方法全面鉴定和分析了珍珠粟中的PgWD40基因家族及其表达模式。研究结果显示,共鉴定出209个PgWD40基因家族成员,通过对珍珠粟和水稻的系统进化分析将其归为5个亚家族,在同一亚族内的成员中,它们的保守序列和基因结构表现出一定的相似性。此外,通过对启动子顺式作用元件的分析显示, 176个PgWD40基因与植物的生长和发育相关, 208个PgWD40基因成员含有不同激素胁迫响应的顺式作用元件,进一步通过转录组数据分析和qRT-PCR分析显示,PMA3G03393.1、PMA4G00558.1、PMA5G02217.1等基因受到盐、热和干旱胁迫的诱导,表明这些基因可能通过依赖不同激素的信号通路来调控和响应非生物胁迫,可作为进一步研究PgWD40基因家族耐受性功能的候选基因。并且PgWD40基因家族成员在珍珠粟抽穗期的不同时期存在表达差异。通过基因表达热图以及GO和KEGG等分析,发现许多PgWD40基因家族成员参与了植物生长发育和籽粒形成的各个阶段。研究结果为全面解析PgWD40基因结构与生物学功能、耐逆性分子机制以及分子育种提供了理论基础,为今后培育高效抗逆作物新品种提供基因资源。

黑果枸杞WD40编码基因LrAN11的克隆及表达分析

WD40蛋白广泛存在于真核生物中,是一类高度保守的蛋白家族,具有广泛的生物化学和细胞生物学功能。为探索黑果枸杞LrAN11的功能,采用同源克隆的方法克隆了黑果枸杞WD40蛋白基因,将其命名为LrAN11,Gen Bank登录号:KY131959。生物信息学分析结果表明,该基因的编码区长1 029bp,编码342个氨基酸,蛋白分子量为38.3 kD,理论等电点为4.95,含有5个WD40基序,属于WD40类蛋白基因家族;经预测LrAN11定位于细胞质中,该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与马铃薯、番茄、甜椒和美花烟草具有较近的亲缘关系;定量RT-PCR检测表明,LrAN11基因在黑果枸杞各组织中均有表达,其中在青果中的相对表达量最高,在根和紫果中次之,而在黑果中表达最低,表明LrAN11可能参与黑果枸杞花青素的生物合成的调控;在韩国枸杞和0901枸杞品种中表达显著,在其他14个枸杞品种中表达均较低且无显著差异性(P>0.05),说明LrAN11的表达具有品种特异性。此外,随着NaCl处理时间的延长,该基因的表达量先降低后升高,且在2、12和24 h的表达量与对照相比存在显著差异性(P<0.05),说明LrAN11可能参与黑果枸杞对盐胁迫的响应。本研究结果为进一步阐明黑果枸杞LrAN11基因的功能及其在黑果枸杞遗传改良中的应用奠定了基础。

牡丹WD40类转录因子基因PsWD40-1和PsWD40-2的分离与序列分析

利用已构建的牡丹‘洛阳红’花瓣转录组数据库,筛选得到2个与植物花青素苷合成WD40蛋白同源性较高的Unigene序列,分别命名为PsWD40-1和PsWD40-2。利用RT-PCR技术,设计特异性引物对PsWD40-1和PsWD40-2最大阅读框(ORF)序列进行扩增,测序结果表明PsWD40-1序列包含一个1 035 bp的ORF,编码一个344 aa的肽链;PsWD40-2序列包含一个1 032 bp的ORF,编码一个343 aa的肽链。牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推测所编码蛋白序列均具有典型的WD40结构域。PsWD40-1蛋白序列与葡萄VvWDR2相似性为96%,PsWD40-2蛋白序列与葡萄VvWDR1相似性为87%。系统进化树分析发现,PsWD40-1与葡萄VvWDR2、拟南芥AtAN11、陆地棉GhTTG2等序列聚在MP1分支,而PsWD40-2与葡萄VvWDR1、矮牵牛PhAN11、紫苏PfWD40等序列聚在另一分支TTG1/PAC1分支。

海南龙血树WD40转录因子基因DcWD40-1的克隆和表达分析

海南龙血树是国产血竭的主要基源植物,其血竭主要化学成分为类黄酮化合物。为进一步了解DcWD40-1在类黄酮生物合成中的潜在功能和作用机制,该研究根据海南龙血树转录组数据,利用RT-PCR技术在海南龙血树中克隆了一个WD40基因DcWD40-1,该基因全长1550 bp,包含一个1353 bp的开放阅读框,编码450个氨基酸,蛋白质分子量50.77 kD,理论等电点5.71。生物信息学分析显示,DcWD40-1属于WD40蛋白家族成员,具有5个保守的WD40结构域,和其他植物WD40蛋白同源性高,保守性强。利用Genome Walking方法分离了1503 bp的DcWD40-1启动子序列,该区域具有典型真核生物启动子结构特征,并含有多个应答激素和胁迫的响应元件。表达分析显示,血竭诱导剂能够诱导Dc WD40-1的表达,DcWD40-1的变化与血竭形成及类黄酮积累正相关。此外,DcWD40-1也能对茉莉酸甲酯、细胞分裂素、油菜素内酯和UV-B处理做出积极响应。

亚洲牛带绦虫WD40基因表达及免疫学分析

目的对亚洲牛带绦虫WD40基因进行克隆、表达和免疫学研究。方法将亚洲牛带绦虫成虫WD40基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用免疫印迹试验(Western Blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明,pET-28a(+)-WD40重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠埃希菌BL-21/DE3中获得高效表达。重组蛋白能识别感染了亚洲牛带绦虫的猪血清和患者血清,表明其具有免疫反应性。结论亚洲牛带绦虫WD40基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达,为进一步研究该蛋白的功能提供了基础依据。

银杏两个WD40转录因子基因克隆及序列分析

WD40转录因子也称WDR(WD repeat)蛋白,是一种古老蛋白家族,参与调节类黄酮次生代谢途径中多种酶基因的表达,从而影响类黄酮的积累。以三年生银杏苗为试材,采用RT-PCR和RACE-PCR方法,研究了银杏WD40基因序列,以期深入了解银杏叶类黄酮合成代谢的分子机理。结果表明:GbWD401序列包含一段2 313bp的开放阅读框,编码一个770aa的肽链;GbWD402序列包含一段1 605bp的开放阅读框,编码一个534aa的肽链。银杏GbWD401和GbWD402基因推测编码蛋白序列均含有典型WD40重复基序。GbWD401蛋白序列与无油樟AtWD401相似性为49%,GbWD402蛋白序列与无油樟AtWD402相似性为78%。系统进化树发现,GbWD401与无油樟AtWD401、荷花NnWD40划归为同一分支;而GbWD402与无油樟AtWD402划归为另一分支。

云香水仙WD40基因克隆及序列分析

目的探讨云香水仙WD40基因在花色形成中的作用。方法基于前期的转录组数据,以云香水仙为材料,采用RT-PCR技术对WD40基因进行克隆,并结合Real-time PCR检测其在不同花期的表达水平。结果克隆得到1个WD40基因,命名为NtWD40,开放阅读框长为1020 bp,共编码339个氨基酸。同源性分析表明,云香水仙与拟南芥、苹果、矮牵牛及苜蓿的相似系数分别为68%、68%、68%和69%。Real-time PCR分析表明:始花期NtWD40的表达量较其他花期有明显差异。结论NtWD40可能参与云香水仙类黄酮途径相关色素的合成。

蓖麻RcWD40家族鉴定与表达分析

植物中的WD40蛋白家族通过蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA的互作,参与生物过程,该家族的重要成员TTG1在拟南芥中抑制种子脂肪酸的过早积累。为揭示油料作物蓖麻中RcWD40基因家族及RcTTG1基因的表达特征,利用生物信息学手段在全基因组水平鉴定到182个RcWD40家族成员,其中RcWD40-181为RcTTG1基因,并对它们的系统发育、保守结构域及表达模式等进行分析。根据进化树结构和保守域组成分别将RcWD40家族成员分为8个cluster和28个亚家族。此外,转录组分析显示RcWD40在蓖麻的花、叶、根、茎以及各发育时期种子中具有多样的表达模式,预测家族基因可能调节这些组织的生长发育。启动子区域转录因子结合位点及种子发育表达分析结果预测RcTTG1可能承担与AtTTG1相似的脂肪酸积累负调节功能。

多刺绿绒蒿WD40基因家族的鉴定及生物信息学分析

WD40转录因子家族广泛参与调节植物生长、发育、次生代谢物积累和环境适应等过程。为了探究WD40家族在多刺绿绒蒿生长、发育和次生代谢物积累以及抗逆方面的作用,该研究基于全长转录组测序数据,鉴定了多刺绿绒蒿WD 40基因家族成员,并对这些基因及其编码的蛋白进行了生物信息学分析。结果表明:(1)共鉴定到19个WD 40基因,编码的蛋白均具有WD40结构域,氨基酸数目为109~758 aa,分子量介于11830~84130 Da之间,预测大多数蛋白定位在细胞核中且都为亲水性蛋白;(2)系统进化树分析表明多刺绿绒蒿与罂粟、博落回亲缘关系较近;(3)WD 40基因启动子区域均存在数量不等的激素或逆境响应元件,表明该家族基因可能参与植物生长、发育和次生代谢物积累等多种生物学进程的调节;(4)蛋白三级结构显示这些蛋白在进化过程中发生了不同程度的进化。这些结果可为深入研究多刺绿绒蒿WD 40基因家族在其响应逆境胁迫和次生代谢物积累等方面的具体机制提供前期基础。

水稻花色素苷合成调节基因hrd1(t)的鉴定

【目的】对籼稻种质hrd1紫叶性状进行遗传分析和基因定位。【方法】在特籼占13与02428杂交后代中获得籼稻紫叶材料hrd1。对hrd1主要农艺性状及表型进行观察;配制hrd1与02428的F1、F2、BC1F1群体,观察紫叶与绿叶性状的分离情况,明确其遗传模式;进一步利用F2群体实现紫叶性状基因的精细定位和候选基因遴选。【结果】hrd1在2叶期的叶尖出现紫色,并逐步扩散至全株大部分组织,成熟期农艺性状与对照(特籼占13)具有较大差异。hrd1叶绿素含量正常,花色素苷含量显著高于对照。遗传分析表明其紫叶性状受1对隐性核基因hrd1(t)控制,该基因位于第4染色体InDel标记HRD10和HRD21之间,物理距离为32.5 kb。对该区域候选基因测序,发现hrd1在LOC_Os04g50660基因(编码WD和G-beta重复域蛋白)的第3外显子发生单碱基突变(A→C),导致其编码的第196位氨基酸由对照的赖氨酸变为苏氨酸。【结论】hrd1(t)编码WD40类转录因子,可能参与花色素合成调控。

血红鸡爪槭叶片WD_(40)转录因子的克隆及序列分析

以血鸡爪槭叶片总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE-PCR的方法,研究血红鸡爪槭叶片花色素苷的合成机理,成功获得了调控花色素苷表达的转录因子WD_(40)基因。结果表明:WD_(40)基因全长1 104 bp,编码337个氨基酸。通过NCBI中的Blast软件对其进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性进行分析,表明所获得的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它物种的转录因子WD_(40)有较高的同源性,并且C端含有4个WD重复基序,推断该基因为血红鸡爪槭的WD_(40)转录因子。

华东葡萄VpWDR基因的克隆、表达及亚细胞定位分析

【目的】探索中国葡萄野生种抗白粉病候选基因VpWDR与白粉病抗性的相关性。【方法】以中国野生华东葡萄(Vitis pseudoreticulata)叶片为植物材料,采用RACE技术对华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’叶片cDNA文库测序获得的WDR基因EST序列片段进行全长克隆,利用实时荧光定量PCR技术分析VpWDR在华东葡萄抗白粉病株系‘白河-35-1’叶片中受白粉菌侵染后的表达变化,采用基因枪介导的瞬时转化技术检测VpWDR表达产物在洋葱表皮细胞内的定位。【结果】获得了华东葡萄VpWDR mRNA全长1 577 bp,开放阅读框1 377 bp,3'UTR 138 bp,5'UTR 62 bp,编码458个氨基酸,理论等电点为5.07,预测分子量为51.7 kDa;核酸和编码的氨基酸序列同源性分析结果表明,VpWDR属于WD40蛋白基因家族,并命名为VpWDR;在人工接种葡萄白粉菌后的葡萄叶片进行基因表达分析,表明该基因在葡萄叶片中受白粉菌诱导先上调表达,再回到原始水平,最大值出现在接种后12 h,表达量约为内参基因β-Actin的2.8倍;此外,亚细胞定位结果表明该基因编码的蛋白定位于细胞核、细胞质和细胞膜,无亚细胞特异性分布。【结论】VpWDR蛋白定位于细胞核、细胞质和细胞膜位。并且VpWDR基因对白粉菌产生响应,从而推测该基因可能参与葡萄白粉菌侵染过程中的抗病反应。

人类新基因WDR24的研究初报

WD40家族是一类结构保守、功能复杂的蛋白。目前很多研究显示该家族成员通过参与MAPK信号途径调控细胞内信号转导而影响细胞的基本生命活动。为了鉴定参与细胞生命活动的新基因,运用同源基因克隆法,通过PCR技术扩增获得一个新的人类基因WDR24,其cDNA全长3 302 bp,2 373 bp长的开放阅读框编码由790个氨基酸残基组成的蛋白质。生物信息学分析表明,WDR24蛋白在进化上高度保守,与其他脊椎动物中的同源蛋白组成了一个功能未知的亚家族。蛋白序列分析显示其中有6个WD40重复序列和1个ERK的停泊位点D-domain。RT-PCR分析表明,该基因在所有被检测的人类胚胎组织中表达。

番茄Sl WDR204基因正调控植物干旱胁迫

为了进一步研究Sl WDR204的功能,克隆了番茄的Sl WDR204基因,通过亚细胞定位为研究其功能提供线索,并通过农杆菌介导法,利用RNAi技术获得Sl WDR204基因下调的转基因植株。干旱胁迫试验表明,转基因番茄对干旱胁迫更加敏感,说明Sl WDR204基因正向调控植物对干旱的响应,这一发现为分子育种提供了新的靶标基因,并为阐明植物抗旱的分子机理奠定了基础。

菰黑粉菌Rak1同源基因UeRak1的克隆及表达分析

采用PCR技术克隆获得一个编码7个WD-重复序列蛋白的基因UeRak1.UeRak1基因全长1 994bp,有1个974bp大小的内含子,开放阅读框1 020bp,编码339个氨基酸,UeRak1具有保守的WD40结构域,为Gβ同源蛋白,结构及聚类分析结果表明UeRak1与玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)中的Rak1亲缘关系最近.实时荧光定量PCR结果显示UeRak1的表达量在细胞融合生长期急剧升高;当气生菌丝开始生长后表达量开始下降;在菰黑粉菌MT-1和T-1中UeRak1的表达趋势基本没有差别;但是MT-1菌株中UeRak1基因的表达量均不到T-1菌株的一半.表明UeRak1基因与菰黑粉菌细胞融合和菌丝生长具有紧密的联系.

红花CtWD40转录因子家族基因的生物信息学分析

WD40转录因子家族是真核生物中广泛存在的基因超家族,与植物生长及发育调控密切相关。并且在以往的研究中发现WD40转录因子参与花色苷的合成,而花色苷是红花类黄酮化合物的重要组成之一。该研究通过生物信息学手段及基因表达分析方法鉴定了红花基因组中40个CtWD40家族成员。研究根据拟南芥等植物WD40蛋白序列及系统发育特点将红花CtWD40家族归为7个亚家族,结合保守基序分析揭示每个亚家族成员特定的保守基序与基因结构,发现进化关系邻近的家族成员在保守基序与基因结构上具有一定的相似性。其次,基因启动子顺式作用元件搜索发现CtWD40特定启动子元件,揭示其可能参与的代谢途径。接下来,使用功能富集分析,分析CtWD40蛋白的功能类别和细胞定位,并通过CtWD40蛋白间相互作用,预测其潜在的调控功能。最后,根据qRT-PCR揭示了红花CtWD40亚家族19个成员在红花不同组织及花期中的差异表达。该研究为红花CtWD40基因功能验证及表达分析提供了理论依据。

橡胶树HbWD40基因家族的全基因组分析

WD40是一类支架蛋白,广泛参与植物的生长发育、花青素的生物合成以及生物和非生物胁迫等生命活动。利用生物信息学技术,本研究从橡胶树基因组中鉴定到258个HbWD40家族成员,并对其染色体分布、蛋白保守结构域、组织特异性表达以及低温胁迫下的表达模式进行系统分析。结果显示, HbWD40成员在18条染色体上均有分布;根据结构域的不同可将HbWD40家族划分为28个亚族;表达模式分析发现有175个成员在所有5个组织中均有表达,并鉴定到8个在低温胁迫下差异表达的成员。利用RT-PCR技术克隆了橡胶树的HbWD40-168基因。该基因CDS长1 335 bp,编码444个氨基酸。保守结构域分析显示HbWD40-168含有4个WD40重复元件和2个ZnF_C3H1锌指蛋白结构域。启动子分析显示HbWD40-168启动子区域存在多种激素或胁迫相关顺式作用元件。亚细胞定位显示HbWD40-168定位于细胞核。本研究为深入鉴定HbWD40家族在橡胶树中的生物学功能提供基础。

基于全长转录组数据的尼泊尔黄堇WD40基因家族鉴定及进化分析

WD40(WD40 domain-containing proteins)转录因子家族广泛参与调节植物生长、发育、次生代谢物积累和环境适应等过程并发挥着重要作用。本研究利用生物信息学手段对25个WD40家族成员的理化特性、启动子顺式作用元件、保守基序、结构域、进化关系和蛋白三级结构进行了分析。结果表明:尼泊尔黄堇中多数WD40蛋白为酸性,且大多为不稳定蛋白,25个WD40蛋白的脂肪族系数均小于100,为亲水性蛋白,并且二级结构以无规则卷曲和延伸链为主,亚细胞定位发现大多在细胞核中。尼泊尔黄堇WD40蛋白具有共同的保守结构域WD40且数量在1~7之间变化。对家族各成员启动子序列中包含的顺式作用元件进行了分析,发现该基因家族含有多种胁迫及植物激素相关的顺式作用元件。进化树分析将尼泊尔黄堇WD40蛋白家族成员分为7个亚家族(Ⅰ~Ⅶ),推测不同类型的WD40蛋白功能存在差异。本研究首次鉴定了尼泊尔黄堇WD40转录因子家族,并揭示了结构特征,这将为深入解析尼泊尔黄堇WD40转录因子在其响应逆境胁迫和其次生代谢产物积累方面的生物学功能提供重要参考。

过量表达SlWD6基因增强番茄抗旱和耐盐功能

WD40蛋白广泛存在于真核生物体内,在生物体内协助细胞行使多种功能,目前关于WD40蛋白的研究多集中在拟南芥菜和水稻中.生物信息学分析显示,SlWD6蛋白包含两个保守的WD-repeat结构域,属于WD40家族.为了解番茄中SlWD6基因的功能,采用RT-PCR方法检测番茄的根、茎、叶、花和不同发育时期果实中SlWD6基因表达量.利用RT-PCR方法获得SlWD6基因全长,并且构建SlWD6过量表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因植株,利用Realtime PCR检测3个独立的转基因株系(WD6-393、WD6-418和WD6-421)中SlWD6基因的表达量,并进行耐盐和抗旱性分析.结果显示,番茄SlWD6基因为组成型表达,果实各时期表达量较高,在红果时期表达量达到最高;转基因株系中SlWD6基因的表达量显著高于野生型;在干旱和高盐胁迫下,转基因植株叶片脯氨酸(Pro)含量显著高于野生型,丙二醛(MDA)含量与野生型相比则显著降低.用Na Cl和甘露醇介导耐盐和干旱胁迫,SlWD6转基因植株T2代种子的根长和苗长显著高于野生型植株.综上,SlWD6基因的过量表达能够显著增强番茄的抗旱和耐盐功能.

百合TTG1基因的克隆、表达及其与MYB和bHLH的互作分析

以东方百合‘Indiana’(Lilium‘Indiana’)为材料,克隆得到一个LhTTG1基因,并研究了其生物信息学特征、时空表达及其与R2R3-MYB和bHLH的互作。序列分析显示,LhTTG1的编码序列全长1023 bp,编码340个氨基酸。LhTTG1为一个包含有4个串联的WD-repeat结构域的WD40蛋白。LhTTG1与油点草、非洲油棕及其他单子叶植物的TTG1蛋白具有较高的同源性。通过定量RT-qPCR分析LhTTG1基因的时空表达,揭示该基因主要在花瓣中表达,在着色时期花蕾的表达最高。亚细胞定位显示,LhTTG1主要在细胞质和细胞核内表达。酵母双杂交结果显示,LhTTG1可以与LhMYB12和LhbHLH1互作形成MBW复合物。以上结果为进一步研究LhTTG1的功能鉴定提供了帮助。