基于生物信息学分析微小隐孢子虫含WD40结构域的蛋白功能

目的对微小隐孢子虫中含WD40结构域的蛋白进行生物信息学分析,分析该蛋白家族的WD40结构并预测其功能,为微小隐孢子虫基因功能的研究提供一定的基础理论。方法通过隐孢子虫基因组数据库收集数据,获得微小隐孢子虫含WD40结构域蛋白家族的序列信息,搜索每个蛋白的CDD结构域并进行NCBI BLAST比对分析,确定为WD40结构域家族蛋白,分析结构域并预测功能。结果在C.parvum Iowa II中共搜索到50个含有WD40结构域的蛋白,其中cgd1_1930、cgd5_740和cgd4_3360含有CAF1C_H4-bd超家族结构,可能参与DNA修复和DNA复制过程;cgd4_260含有ACE1-Sec16-like超家族,可能参与囊泡的形成和物质运输;cgd1_2600含有TAF5_NTD2结构域,可能参与蛋白与蛋白的相互作用。结论在微小隐孢子虫中,WD40蛋白家族不仅可能单独发挥作用,而且还能通过相互辅助、结合发挥其生物效应。

弓形虫中含WD40结构域蛋白TGME49_228400的生物学功能研究

利用CRISPR/Cas9技术成功构建了弓形虫Ⅱ型Pru虫株的TGME49_228400定位株和缺失株(PruΔ228400),研究了TGME49_228400在弓形虫中的亚细胞定位和基本生物学功能。Western-blot结果显示TGME49_228400蛋白大小为69.9 ku。间接免疫荧光检测显示,TGME49_228400定位于顶质体,TGME49_228400缺失后对弓形虫顶质体的形态无影响。与Pru野生株相比,TGME49_228400缺失株形成噬斑和增殖的能力均显著减弱(P<0.01),而入侵、逸出、体外缓殖子转化能力和对小鼠的毒力无显著差异(P>0.05)。本研究结果可为后续阐明弓形虫中其他含WD40结构域蛋白的功能和作用机制奠定基础。

日本血吸虫信号通路相关基因SjWD101的生物信息学分析及其克隆与表达

目的利用生物信息学方法分析日本血吸虫SjWD101的结构和功能特征,并利用基因工程技术进行克隆和表达,获得相应的重组蛋白。方法从日本血吸虫GenBank数据库中筛选WD家族蛋白中全长基因,用相关软件进行生物信息学预测。通过RT-PCR扩增出全长编码区序列,克隆到表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达,表达产物用镍离子金属螯合剂亲和层析柱纯化并经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白印迹(Western blotting)鉴定。结果SjWD101是一个全长1085bp的基因,编码区为66～950,编码294个氨基酸,软件分析表明其理论分子量和等电点分别是31819.7Da和6.44.亚细胞定位分析表明该蛋白是胞浆蛋白,理化性质较稳定。二级结构以反向平行的β折叠为主。含有6个WD40结构域,属于WD蛋白家族中的一员,具有GTP结合蛋白的结构特征。经PCR、双酶切和测序证实pET-28a(+)-SjWD101构建成功。SDS-PAGE和Western blotting证实重组菌成功表达出融合蛋白,经His亲和层析柱获得了纯化的重组蛋白,Western blotting证实WD101重组蛋白能被感染日本血吸虫的兔血清识别。结论日本血吸虫WD101经生物信息学预测为WD家族蛋白,可能在血吸虫信号转导通路方面有其一定作用,本研究获得了纯化的重组蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

人类新基因WDR70的克隆及初步研究

运用基于基因组数据库的特定基因同源新基因的克隆策略得到一个人类新基因WDR70 ,该基因编码一个包含 12个WD4 0结构域的蛋白。WDR70的cDNA序列长 2 2 6 6bp ,预测编码蛋白含 6 30个氨基酸 ,理论分子量为 70× 10 3 u ,染色体定位为 17p13.1。以小鼠胚胎为模型进行整体原位杂交 ,结果显示WDR70基因在 8.5d小鼠胚胎中没有表达 ,而在 9.5d和 10 .5d的小鼠胚胎的脑部有特异表达。由此推断该基因对胚胎期脑部的发育有重要的影响。

PER1与RACK1蛋白作用位点分析

目的筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域。方法采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用。结果酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1(WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用。结论RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于、、三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位。

拟南芥和大白菜LUG蛋白家族的生物信息学分析

LUG蛋白属于WD40超家族基因,具有7个重复的WD40结构域,参与花器官的发育。本项研究系统鉴定了7个拟南芥和5个大白菜的LUG基因,并对这些基因编码的蛋白质序列进行了序列保守性和系统进化分析。结果表明,除了AtLUG6含有5个重复的WD40结构域之外,其余所有的LUG蛋白都具有7个重复的WD40结构域。在进化上,LUG蛋白家族可分为两个不同的亚家族,并且这种特征在拟南芥和大白菜分离之前就已经形成。

菰黑粉菌Rak1同源基因UeRak1的克隆及表达分析

采用PCR技术克隆获得一个编码7个WD-重复序列蛋白的基因UeRak1.UeRak1基因全长1 994bp,有1个974bp大小的内含子,开放阅读框1 020bp,编码339个氨基酸,UeRak1具有保守的WD40结构域,为Gβ同源蛋白,结构及聚类分析结果表明UeRak1与玉米瘤黑粉菌(Ustilago maydis)中的Rak1亲缘关系最近.实时荧光定量PCR结果显示UeRak1的表达量在细胞融合生长期急剧升高;当气生菌丝开始生长后表达量开始下降;在菰黑粉菌MT-1和T-1中UeRak1的表达趋势基本没有差别;但是MT-1菌株中UeRak1基因的表达量均不到T-1菌株的一半.表明UeRak1基因与菰黑粉菌细胞融合和菌丝生长具有紧密的联系.