基于转录组信息的黑果枸杞WD40蛋白质家族分析

WD40蛋白质为真核生物中一种常见蛋白质,广泛参与植物生长发育的多种生物过程,在蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA的相互作用中发挥重要作用。为系统分析黑果枸杞WD40蛋白质家族成员,本研究以黑果枸杞青色期、转色期和成熟期3个发育时期的果实转录组测序数据为基础,结合Nr、Nt、Pfam、KOG/COG、Swiss-prot、KEGG及GO 7个数据库和NCBI网站,对黑果枸杞WD40蛋白质编码基因进行筛选注释。结果表明,共得到77个黑果枸杞WD40蛋白质家族成员,黑果枸杞WD40蛋白质结构域组成多样,且在不同物种间高度保守;亚细胞定位预测分析表明,黑果枸杞WD40蛋白质家族成员多位于细胞核及细胞质中;黑果枸杞和拟南芥WD40蛋白质共建的系统进化树可分为五个亚家族; WD40蛋白质家族成员编码基因随果实发育的表达模式表明,黑果枸杞WD40蛋白质家族成员可能参与了其果实花青素的变化调控。本研究结果为枸杞WD40蛋白质的分离及功能研究奠定了一定的理论基础。

拟南芥WD40蛋白

拟南芥植物中已经鉴定出十几个WD40蛋白。本文介绍这些蛋白在拟南芥生长发育过程中的功能及其分子机制的研究进展。

WD40编码的P53 RNA反义转录子基因和蛋白及其功能

WD40编码的P53 RNA反义转录子(WRAP53)基因有1α、1β和1γ三个起始外显子,1α与P53的第一外显子反向互补,其表达产物能稳定P53 RNA水平,从而促进P53蛋白表达,最终参与调控肿瘤的生物学行为;1β转录翻译生成的WRAP53蛋白,涉及细胞程序性死亡、周期调控以及蛋白酶降解和RNA代谢等多个重要生化过程。WRAP53蛋白主要通过与端粒酶复合体等多种组分结合参与端粒酶卡侯体(CB)的形成、端粒酶全酶的组装定位、端粒酶的运输,指导运动神经元生存蛋白定位至CB等。WRAP53基因在肿瘤细胞系和临床肿瘤样本中普遍高表达,且表达越高,肿瘤的预后越差。沉默WRAP53基因,可明显抑制肿瘤细胞的生长和成瘤能力。先天性角化不良综合征与端粒长度的缩短有关,WRAP53基因表达降低最终会导致端粒的缩短。

植物体中WD40蛋白的研究进展

为了更深入了解WD40蛋白结构及调控机理,使其更好地发挥作用,对近年来WD40蛋白在植物花青素苷生物合成,非生物胁迫响应以及植物生长发育等的研究进展作了综述,并对其未来的研究方向进行了展望。

WD40重复蛋白43在肺腺癌中的表达及其对细胞紫杉醇耐药的影响

目的·分析WD40重复蛋白43 (WD 40 repeat protein 43, WDR43) mRNA在肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)细胞中的表达及其与LUAD患者预后的相关性,并探讨WDR43对LUAD细胞发生紫杉醇耐药的影响。方法·通过癌症治疗反应门户网站(Cancer Therapeutics Response Portal,CTRP),下载LUAD细胞的紫杉醇敏感性与其基因表达的相关性系数,筛选紫杉醇耐药相关基因,行基因本体数据库(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)通路分析,并以相关基因WDR43作为研究对象行后续分析及验证。检索人类蛋白图谱(Human Protein Atlas,HPA)数据库,分析WDR43蛋白在LUAD组织中的表达和定位。检索癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库,分析WDR43 mRNA在LUAD组织和正常肺组织中的表达差异、LUAD患者的WDR43突变情况以及WDR43 mRNA与不同临床病理因素的相关性。检索CaArray数据库,分析WDR43 mRNA与LUAD患者预后之间的相关性。检索肿瘤浸润性免疫细胞分析(Tumor Immune Estimation Resource,TIMER)数据库,分析WDR43表达与LUAD组织中免疫细胞浸润水平的相关性。通过癌症细胞系百科全书(Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE)数据库比较不同LUAD细胞中WDR43基因表达,构建差异表达WDR43的LUAD细胞,并采用MTT实验和平板克隆形成实验验证WDR43表达对紫杉醇耐药性的影响。结果·通过CTRP筛选出了LUAD细胞紫杉醇敏感性相关基因WDR43。GO功能分析和KEGG通路分析的结果显示,WDR43等基因与rRNA合成、细胞形态调控等相关,且主要富集在单纯疱疹病毒1感染信号通路和胞浆DNA感受器信号通路。HPA数据库的分析结果显示,WDR43蛋白主要表达于LUAD细胞的细胞核、细胞质及细胞膜中。TCGA数据库的分析结果显示,WDR43 mRNA在LUAD组织中的表达明显高于正常肺组织(P=0.000),在LUAD吸烟患者的癌组织中的表达明显高于非吸烟者(P=0.000),在TP53突变型患者中的表达亦高于TP53野生型患者(P=0.000)。CaArray数据库的分析结果显示,WDR43 mRNA高表达的LUAD患者的预后较差(均P=0.000)。TIMER数据库的分析结果显示,WDR43表达可促进LUAD组织中的中性粒细胞、CD8^(+)T细胞、骨髓来源的抑制性细胞、巨噬细胞的浸润,抑制CD4^(+)T细胞的浸润。体外实验证实,过表达WDR43可增强LUAD细胞对紫杉醇的耐药能力。结论·WDR43在LUAD组织中的表达显著增加且与患者预后呈负相关,WDR43的过表达可增强LUAD细胞的紫杉醇耐药能力。

黑果枸杞WD40编码基因LrAN11的克隆及表达分析

WD40蛋白广泛存在于真核生物中,是一类高度保守的蛋白家族,具有广泛的生物化学和细胞生物学功能。为探索黑果枸杞LrAN11的功能,采用同源克隆的方法克隆了黑果枸杞WD40蛋白基因,将其命名为LrAN11,Gen Bank登录号:KY131959。生物信息学分析结果表明,该基因的编码区长1 029bp,编码342个氨基酸,蛋白分子量为38.3 kD,理论等电点为4.95,含有5个WD40基序,属于WD40类蛋白基因家族;经预测LrAN11定位于细胞质中,该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与马铃薯、番茄、甜椒和美花烟草具有较近的亲缘关系;定量RT-PCR检测表明,LrAN11基因在黑果枸杞各组织中均有表达,其中在青果中的相对表达量最高,在根和紫果中次之,而在黑果中表达最低,表明LrAN11可能参与黑果枸杞花青素的生物合成的调控;在韩国枸杞和0901枸杞品种中表达显著,在其他14个枸杞品种中表达均较低且无显著差异性(P>0.05),说明LrAN11的表达具有品种特异性。此外,随着NaCl处理时间的延长,该基因的表达量先降低后升高,且在2、12和24 h的表达量与对照相比存在显著差异性(P<0.05),说明LrAN11可能参与黑果枸杞对盐胁迫的响应。本研究结果为进一步阐明黑果枸杞LrAN11基因的功能及其在黑果枸杞遗传改良中的应用奠定了基础。

牡丹WD40类转录因子基因PsWD40-1和PsWD40-2的分离与序列分析

利用已构建的牡丹‘洛阳红’花瓣转录组数据库,筛选得到2个与植物花青素苷合成WD40蛋白同源性较高的Unigene序列,分别命名为PsWD40-1和PsWD40-2。利用RT-PCR技术,设计特异性引物对PsWD40-1和PsWD40-2最大阅读框(ORF)序列进行扩增,测序结果表明PsWD40-1序列包含一个1 035 bp的ORF,编码一个344 aa的肽链;PsWD40-2序列包含一个1 032 bp的ORF,编码一个343 aa的肽链。牡丹PsWD40-1和PsWD40-2基因推测所编码蛋白序列均具有典型的WD40结构域。PsWD40-1蛋白序列与葡萄VvWDR2相似性为96%,PsWD40-2蛋白序列与葡萄VvWDR1相似性为87%。系统进化树分析发现,PsWD40-1与葡萄VvWDR2、拟南芥AtAN11、陆地棉GhTTG2等序列聚在MP1分支,而PsWD40-2与葡萄VvWDR1、矮牵牛PhAN11、紫苏PfWD40等序列聚在另一分支TTG1/PAC1分支。

紫色番茄SlWD40-like基因克隆与表达分析

WD-重复蛋白(WD-repeat protein)是一类含有WD40基序的蛋白,在植物响应非生物逆境胁迫的过程中具有重要调控作用。为揭示紫色番茄中WD40重复蛋白的功能,从富含花青素紫色番茄品种‘砚紫1号’中克隆 SlWD40-like基因,并对该基因在不同组织部位和不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明, SlWD40-like基因编码1个含有460个氨基酸的蛋白质。蛋白序列分析显示,SlWD40-like蛋白含有6个WD40基序,是典型的WD40重复蛋白。预测分析发现,该蛋白为亲水性蛋白,其二级结构以无规则卷曲为主;该蛋白序列在物种间具有高度的保守性,系统发生进化树分析表明紫番茄SlWD40-like氨基酸序列与潘那利番茄蛋白亲缘关系最近,其次是胡萝卜。应用qRT-PCR分析 SlWD40-like基因组织特异表达发现,该基因在叶和紫色果实中表达量最高。qRT-PCR分析表明, SlWD40-like基因受到盐胁迫、干旱胁迫脱落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)诱导表达,推测该基因可能参与紫色番茄逆境胁迫应答。该研究为后续进一步分析紫色番茄 SlWD40-like基因功能奠定了基础。

核桃WD40转录因子JrATG18a基因的克隆及逆境响应

WD40转录因子在植物逆境响应中具有重要作用。本研究克隆获得核桃的一条WD40家族的自噬相关蛋白(Autophagy-related protein)18a基因(JrATG18a),通过生物信息学和基因表达技术,分析不同非生物及植物激素处理下JrATG18a基因的表达规律,预测JrATG18a的基本生物功能。结果显示,JrATG18a的开放阅读框(ORF)为1371 bp,编码蛋白含456个氨基酸,分子量为50.746 k D,理论等电点为5.97。与草莓、苹果、碧桃等具有较近的进化关系。其启动子含有热激响应(HSE)、低温胁迫(LTR)、水杨酸(SA)响应等相关元件。表达分析发现JrATG18a基因在热、寒、旱、SA、茉莉酸甲酯(Me JA)、脱落酸(ABA)处理下能被不同程度的诱导,且体现出根和叶的表达差异。这些结果表明,JrATG18a基因能响应逆境参与核桃适应不良环境,可作为核桃抗逆分子育种的重要候选基因。

蓖麻RcWD40家族鉴定与表达分析

植物中的WD40蛋白家族通过蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA的互作,参与生物过程,该家族的重要成员TTG1在拟南芥中抑制种子脂肪酸的过早积累。为揭示油料作物蓖麻中RcWD40基因家族及RcTTG1基因的表达特征,利用生物信息学手段在全基因组水平鉴定到182个RcWD40家族成员,其中RcWD40-181为RcTTG1基因,并对它们的系统发育、保守结构域及表达模式等进行分析。根据进化树结构和保守域组成分别将RcWD40家族成员分为8个cluster和28个亚家族。此外,转录组分析显示RcWD40在蓖麻的花、叶、根、茎以及各发育时期种子中具有多样的表达模式,预测家族基因可能调节这些组织的生长发育。启动子区域转录因子结合位点及种子发育表达分析结果预测RcTTG1可能承担与AtTTG1相似的脂肪酸积累负调节功能。

PER1与RACK1蛋白作用位点分析

目的筛选人下丘脑视交叉上核(SCN)区域内与PERIOD1(PER1)相互作用的新蛋白,研究RACK1与PER1的作用特点,明确其结合的关键结构域。方法采用酵母双杂交方法,筛选得到人SCN区域内与PER1-PAS结构域相互作用的新蛋白,并构建5种表达不同长度RACK1片段的酵母文库质粒与PER1诱饵质粒共转染酵母AH109进行杂交,通过营养缺陷筛选、报告基因检测获得阳性克隆,并采用体外转录、免疫共沉淀实验证实阳性克隆蛋白间的相互作用。结果酵母双杂交筛选得到人SCN区域内表达RACK1蛋白的克隆,重组RACK1表达质粒与PER-PAS诱饵质粒进行酵母双杂交筛选后得到三个阳性克隆:RACK1(WD1-7)、RACK1(WD4-7)和RACK1(WD5-7),β-半乳糖苷酶测试阳性证实报告基因表达,免疫共沉淀结果显示阳性克隆与PER1蛋白间存在相互作用。结论RACK1与PER1存在直接相互作用,RACK1含有7个WD40结构域,本研究发现与PER1结合的最小区域位于、、三个WD40结构域,提示其碳端序列为其结合的关键部位。

拟南芥和大白菜LUG蛋白家族的生物信息学分析

LUG蛋白属于WD40超家族基因,具有7个重复的WD40结构域,参与花器官的发育。本项研究系统鉴定了7个拟南芥和5个大白菜的LUG基因,并对这些基因编码的蛋白质序列进行了序列保守性和系统进化分析。结果表明,除了AtLUG6含有5个重复的WD40结构域之外,其余所有的LUG蛋白都具有7个重复的WD40结构域。在进化上,LUG蛋白家族可分为两个不同的亚家族,并且这种特征在拟南芥和大白菜分离之前就已经形成。

番茄SlWDR141基因的克隆及功能研究

为研究番茄WD40蛋白基因(SlWDR141)的功能,对SlWDR141蛋白进行生物信息学分析,发现SlWDR141蛋白在进化过程中高度保守,与土豆的同源性最高。在克隆SlWDR141基因全长序列的基础上,构建了亚细胞定位和酵母双杂交表达载体,证实SlWDR141蛋白主要定位在细胞核中,与DDB1具有相互作用。实时荧光定量PCR(real-time PCR)分析SlWDR141基因在组织中的表达谱,发现它在各个组织中均有表达,但在根中的表达量最高。为研究该基因的生物学功能,进一步构建了SlWDR141基因的干涉载体,用农杆菌介导法转化番茄得到转基因阳性番茄,荧光定量PCR鉴定出3个表达量下调的独立转基因株系。NaCl胁迫和Pst DC3000侵染野生型和转基因植株发现,转基因植株相对于野生型植株抗盐性和抗病性均下降,表明SlWDR141基因对盐胁迫和细菌侵染均起正调控作用。

番茄Sl WDR204基因正调控植物干旱胁迫

为了进一步研究Sl WDR204的功能,克隆了番茄的Sl WDR204基因,通过亚细胞定位为研究其功能提供线索,并通过农杆菌介导法,利用RNAi技术获得Sl WDR204基因下调的转基因植株。干旱胁迫试验表明,转基因番茄对干旱胁迫更加敏感,说明Sl WDR204基因正向调控植物对干旱的响应,这一发现为分子育种提供了新的靶标基因,并为阐明植物抗旱的分子机理奠定了基础。

酸性核质DNA结合蛋白1的研究进展

酸性核质DNA结合蛋白1(And-1/WDHD1)是一种天然嵌合蛋白,其包含WD40重复序列(WD-repeat)和高迁移率组蛋白框结构域(HMG-box motif)两大蛋白家族特性。And-1在多种肿瘤细胞中过表达,在整个细胞周期过程中参与了预复制复合体(Pre-RC)的组装、DNA复制、检查点激活、DNA修复以及姐妹染色单体内聚等多种功能调控。And-1可作为细胞周期调控的新型靶点,用于广谱抗癌新药的开发。本文重点针对近年来And-1的结构特征、生化功能及在癌中的潜在作用等研究进行综述,以期望为And-1进一步的研究和新药开发提供参考。

WD40重复蛋白家族基因At1g65030调控拟南芥种子的重量与体积

植物中WD40-repeat蛋白在细胞周期调控等方面具有重要作用。本研究鉴定了一株拟南芥WD40-repeat蛋白基因突变体at1g65030,与野生型植株相比种子重量增重体积变大,营养生长长势较弱,角果种子结实率较低。以突变体作为母本/父本与野生型父本/母本杂交,前者杂交后代未显示有母本的突变表型,后者部分杂交后代显示出父本的突变表型,统计突变体后代分离比符合1:1。用苯胺兰(DAB)、4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、碘-碘化钾花粉染色,发现花粉部分败育且主要为核败育。爱氏苏木精花粉染色结果显示可观察到正常减数分裂各时期形态。采取热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)方法确认突变基因位于第一条染色体65030位置,生物信息学分析表明该基因含有DWD基序。半定量RT-PCR分析发现在拟南芥发育晚期该基因在花器官中大量表达,过表达该基因使种子重量减轻。推测At1g65030影响了拟南芥花粉发育细胞核有丝分裂过程,该研究增加了人们对调控拟南芥花粉发育分子机制的认识。

花青素合成中的WD40蛋白

本文着重概述了不同植物中花青素合成WD40类转录调控因子的研究进展。

F框WD40域蛋白7在胃癌组织的表达变化及对细胞增殖和上皮-间充质转化的影响

目的观察F框WD40域蛋白7(FBXW7)在胃癌中的表达变化及对细胞增殖和上皮-间充质转化(EMT)的影响。方法选取2016年3月到2019年3月郑州大学附属医院南阳中心医院经手术切除的154例胃癌组织和癌旁组织作为研究材料,采用蛋白质印迹法(Western blot)分析肿瘤组织和癌旁组织中FBXW7蛋白表达水平。采用慢病毒在胃癌细胞SGC-7901中构建FBXW7过表达细胞株(FBXW7组)和对照细胞株(对照组)。采用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)和细胞计数试剂盒(CCK-8)分析两组细胞增殖水平;采用Western blot分析两组细胞EMT标记分子蛋白表达水平。采用含基质胶的Transwell分析细胞的侵袭能力。组间比较采用t检验。结果与癌旁组织FBXW7蛋白表达水平(1.32±0.23)比较,肿瘤组织中FBXW7表达水平(0.52±0.12)显著下调,差异有统计学意义(t=3.091,P<0.05)。与对照组(1.98±0.27)比较,FBXW7组细胞72 h增殖程度(1.21±0.18)显著下降,差异有统计学意义(t=2.615,P<0.05)。与对照组[(54.32±7.32)%]比较,FBXW7组细胞EdU阳性率[(20.98±4.89)%]显著下降,差异有统计学意义(t=3.111,P<0.05)。与对照组细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达水平(0.89±0.19、1.20±0.28、1.39±0.21、1.51±0.26)比较,FBXW7组细胞E-cadherin和ZO-1表达水平(1.98±0.27、2.59±0.31)显著增加,而N-cadherin和Vimentin蛋白表达水平(0.40±0.11、0.53±0.19)显著下调,差异均有统计学意义(t=2.094、2.812、2.458、2.931,P<0.05)。与对照组细胞侵袭数量[(152.69±20.14)个]比较,FBXW7组细胞侵袭数量[(81.44±12.10)个]明显下降,差异有统计学意义(t=4.259,P<0.05)。结论FBXW7在胃癌组织中呈低表达,参与了胃癌细胞的增殖和EMT。

一个莱茵衣藻WD40蛋白正向调控油脂的积累

WD40蛋白（WD40-repeats）一般存在于真核生物中,具有广泛的生理生化功能。本研究以莱茵衣藻一个WD40（Cre12.g552900）蛋白为研究对象,通过遗传转化的方法实现对该基因的敲除和过量表达。转基因藻株检测结果显示Cr WD40 RNAi转基因藻株油脂含量减少了11%~24%,而Cr WD40过量表达转基因藻株油脂含量增加了14.3%~75%,正反两方面实验说明Cr WD40对油脂积累起到正向调控的作用。

福建漳浦野生稻窄叶性状的转录组分析

窄叶性状作为水稻理想株型育种的重要指标之一,直接影响光合作用,进而影响水稻的生物学产量。福建漳浦野生稻具有明显的窄叶特性,但其窄叶性状的分子调控机制尚未明晰。研究以福建漳浦野生稻与宽叶型水稻R527连续回交得到的稳定遗传的窄叶型株系S为材料,以亲本R为对照,进行转录组分析和表型性状测定。结果发现,S株系的剑叶宽度明显变窄,千粒重显著下降,剑叶长度和稻谷粒大小未发生明显变化。通过转录组测序获得650个差异表达基因,其中381个基因上调表达,269个基因下调表达,对其中9个差异基因进行RT-qPCR的分析,结果表明9个差异基因的表达趋势与转录组测序结果基本一致。差异基因主要参与植物激素、DNA损伤修复等方面的代谢通路。WD40蛋白基因均在窄叶株系中上调表达,而大部分糖基转移酶却下调表达,由此推测WD40蛋白和糖基转移酶可能协同影响植物激素、DNA损伤修复等代谢途径调控漳浦野生稻窄叶的形成。