鸡WDR72基因的克隆表达及其相应抗体的制备

WDR72是课题组前期初步鉴定的蛋壳强度相关基因,它是个新基因。本文首先参考GenBank中原鸡(G.gallus)的WDR72基因序列设计3对引物,从仙居鸡子宫组织的cDNA中克隆WDR72基因,并构建家鸡WDR72编码基因的pEGFP-N1真核表达重组质粒;其次,将所克隆的WDR72基因的3′端编码序列构建到原核表达质粒pET-28b,然后利用0.4mmol/L的IPTG于37℃诱导表达WDR72的C端肽链;最后利用500mmol/L的咪唑纯化该肽链,并免疫大白兔制备wdr72特异性多抗。上述工作将为深入研究WDR72基因的生物学特性及其生化功能提供基础。

炎症微环境中WDR72对牙周膜干细胞成骨分化的调节作用

目的探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)诱导的炎症微环境中WDR72对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化的调节作用及机制。方法收集前磨牙样本,分离培养PDLSCs并采用流式细胞术鉴定其干细胞特性。取对数生长期PDLSCs分为对照组(成骨诱导培养液培养)、TNF-α组(含10μg/L TNF-α的成骨诱导培养液培养),培养第7天,采用实时荧光定量PCR法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、RUNX2mRNA相对表达量,采用Western blot法检测WDR5、WDR7、WDR72蛋白相对表达量,筛选出2组表达有差异的蛋白WDR72进行质粒转染;培养第21天采用茜素红染色法观察钙结节并检测540nm波长处吸光度值(OD_(540))。对数生长期PDLSCs分为对照质粒组(成骨诱导培养液培养并转染对照质粒)、对照质粒+TNF-α组(含10μg/L TNF-α的成骨诱导培养液培养并转染对照质粒)、WDR72质粒+TNF-α组(用含10μg/L TNF-α的成骨诱导培养液培养并转染WDR72质粒),培养第7天采用实时荧光定量PCR法检测ALP、OCN、RUNX2mRNA相对表达量,采用Western blot法检测WDR72蛋白相对表达量;培养第21天采用茜素红染色法观察钙结节并检测OD_(540)值。结果PDLSCs表面干细胞标志物CD44、CD90阳性表达率均>99%,CD45、CD34阳性表达率均<1%,分离培养的PDLSCs符合间充质干细胞特性。培养第7天TNF-α组ALP、OCN、RUNX2mRNA(0.56±0.11、0.56±0.10、0.58±0.08)及WDR72蛋白(0.40±0.02)相对表达量均低于对照组(1.00±0.15、1.00±0.13、1.00±0.16、0.72±0.02)(P<0.05),WDR5、WDR7蛋白相对表达量与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养第21天TNF-α组较对照组钙结节数量少、染色浅,TNF-α组OD_(540)值(0.70±0.04)低于对照组(1.90±0.12)(t=9.479,P<0.001)。培养第7天对照质粒+TNF-α组ALP、OCN、RUNX2mRNA(0.57±0.12、0.59±0.11、0.53±0.13)及WDR72蛋白(0.35±0.02)相对表达量均低于对照质粒组(1.00±0.18、1.00±0.14、1.00±0.12、0.78±0.03)和WDR72质粒+TNF-α组(0.95±0.13、0.93±0.15、0.97±0.13、1.10±0.08)(P<0.05)。培养第21天对照质粒+TNF-α组较对照质粒组和WDR72质粒+TNF-α组钙结节数量少、染色浅;对照质粒+TNF-α组OD_(540)值(0.72±0.06)低于对照质粒组(1.87±0.14)和WDR72质粒+TNF-α组(1.69±0.16)(t=7.437,P<0.001;t=5.717,P<0.001)。结论TNF-α诱导的炎症微环境抑制PDLSCs成骨分化与其抑制WDR72表达有关,WDR72参与PDLSCs成骨分化的调控。