CircWHSC1调节miR-107/CLOCK轴对卵巢癌细胞增殖、凋亡和顺铂耐药性的影响

目的:探讨环状RNA(circRNA)WHSC1调节miR-107/生物钟循环输出蛋白(CLOCK)轴对卵巢癌(OC)细胞增殖、凋亡和顺铂(DDP)耐药性的影响。方法:实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blot法检测人正常卵巢上皮细胞IOSE80、卵巢癌细胞(SKOV3、HO-8910、A2780)及卵巢癌DDP耐药株SKOV3/DDP中CircWHSC1、miR-107表达及CLOCK蛋白表达。将SKOV3细胞分为Ct组、si-NC组、si-CircWHSC1组、mimic NC组、miR-107 mimic组、si-CircWHSC1+inhibitor NC组、si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor组;将SKOV3/DDP分为DDP组、DDP+si-NC组、DDP+si-CircWHSC1组、DDP+mimic NC组、DDP+miR-107 mimic组、DDP+si-CircWHSC1+inhibitor NC组、DDP+si-CircWHSC1+miR-107 inhibitor组。qRT-PCR检测SKOV3细胞和SKOV3/DDP细胞中CircWHSC1、miR-107表达;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测SKOV3细胞中CLOCK、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)蛋白表达以及SKOV3/DDP细胞中CLOCK、多药耐药基因(MDR1)蛋白表达;双荧光素酶验证CircWHSC1与miR-107、miR-107与CLOCK的关系。结果:在OC细胞中,CircWHSC1、CLOCK蛋白高表达,miR-107低表达,且SKOV3细胞中CircWHSC1、CLOCK蛋白表达最高,miR-107表达最低(P<0.05)。与SKOV3细胞比较,SKOV3/DDP细胞中CircWHSC1、CLOCK蛋白表达升高,miR-107表达降低(P<0.05);沉默CircWHSC1或上调miR-107可抑制SKOV3细胞增殖,促进细胞凋亡;miR-107 inhibitor减弱了沉默CircWHSC1对SKOV3细胞增殖的抑制、细胞凋亡的促进作用;沉默CircWHSC1或上调miR-107可增强SKOV3/DDP细胞对DDP的敏感性并降低了MDR1蛋白表达;miR-107 inhibitor减弱了沉默CircWHSC1对SKOV3/DDP细胞DDP耐药性的降低作用。双荧光素酶报告基因结果显示,miR-107与CircWHSC1、CLOCK存在靶向关系。结论:沉默CircWHSC1可能通过海绵化miR-107下调CLOCK表达,进而抑制SKOV3细胞增殖,促进细胞凋亡,降低细胞对DDP的耐药性。

Circ-WHSC1通过靶向miR-95-3p上调真核起始因子3B的表达促进非小细胞肺癌细胞增殖的机制研究

目的:探讨Circ-WHSC1通过靶向miR-95-3p上调真核起始因子3B(EIF3B)的表达对非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞增殖的作用。方法:用荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测NSCLC细胞中Circ-WHSC1表达水平。采用细胞计数试剂盒-8(CCK8)检测敲低Circ-WHSC1对NSCLC细胞增殖的影响。通过生物信息学预测、双荧光素酶报告实验、RNA结合蛋白免疫沉淀实验研究miR-95-3p与Circ-WHSC1,EIF3B之间的靶向关系。结果:Circ-WHSC1在NSCLC细胞系中的表达显著高于正常肺上皮细胞;敲低Circ-WHSC1显著降低了NSCLC细胞的增殖活力,而转染miR-95-3p过度表达可逆转此作用;miR-95-3p是Circ-WHSC1的下游靶点,可以被Circ-WHSC1吸附;EIF3B是miR-95-3p的靶基因,可以被Circ-WHSC1间接正向调控。结论:Circ-WHSC1通过靶向调控miR-95-3p/EIF3B轴促进NSCLC细胞的增殖。

组蛋白甲基转移酶WHSC1对三阴性乳腺癌增殖的作用研究

目的:探究组蛋白甲基转移酶WHSC1对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞增殖的影响及可能的作用机制。方法:在癌症基因组图谱(TCGA)中分析WHSC1在人乳腺癌组织中的表达情况。采用人TNBC细胞MDA-MB-231及BT549构建稳定过表达WHSC1的细胞株,利用MTS法、克隆形成实验检测WHSC1对TNBC细胞增殖的影响。将过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞接种至裸鼠皮下后观察移植瘤的生长情况;接种细胞后第20天,剥离移植瘤组织并称重,绘制肿瘤生长曲线;应用免疫组化方法检测移植瘤组织中增殖标志物Ki-67的表达情况。进一步,Western blotting方法检测过表达WHSC1的TNBC细胞中增殖相关分子的表达情况。结果:通过TCGA数据库分析可见,WHSC1在TNBC组织中显著高表达(P<0.001);MTS及克隆形成实验结果显示,过表达WHSC1可增强TNBC细胞的增殖能力(P<0.01);裸鼠皮下成瘤模型实验发现过表达WHSC1可增强TNBC细胞在体内的增殖能力,且免疫组化验证增殖标志物Ki-67表达增多;Werstern blotting结果显示,过表达WHSC1的MDA-MB-231细胞中c-Myc和CDK4蛋白表达水平升高(P<0.01),p21蛋白表达减少(P<0.001)。结论:WHSC1在三阴性乳腺癌中高表达,WHSC1能够促进三阴性乳腺癌细胞的增殖。

套细胞淋巴瘤转化为WHSC1及NOTCH1等基因阳性的淋巴瘤细胞白血病1例报道并文献复习

套细胞淋巴瘤(MCL)为非霍奇金淋巴瘤中B细胞淋巴瘤的一种少见类型,通常起病隐匿,占非霍奇金淋巴瘤的3%~8%。参考我国之前常用的WF分类标准,MCL属于恶性侵袭性淋巴瘤的一种,老年男性多见,疾病确诊时常已至晚期,发病时常伴有肝大及骨髓等其他器官及外周血侵犯,预后差且复发率较高。目前,临床上R-CHOP方案作为治疗MCL的一线药物多数可缓解病情,无完全规范化治疗MCL的方案^([1])。本院血液科收治了MCL转化为WHSC1及NOTCH1阳性的淋巴瘤白血病1例,现报道如下。

利用CRISPR/Cas9构建稳定遗传的斑马鱼WHSC1L1纯合突变体

本研究以斑马鱼为研究对象,成功构建组蛋白甲基化酶WHSC1L1基因敲除的纯合突变体,为研究WHSC1L1在胚胎发育早期组蛋白甲基化修饰的影响提供模型。采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑通过http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/和http://crispr.mit.edu/网站分别对靶位点序列特征和脱靶可能性打分,设计高活性的single-guide RNA(sgRNA)通过TA克隆测序检测到F_0突变效率高达75%,通过F_0代雌雄交配,对得到13条F_1代成体进行逐一剪尾鳍鉴定基因型,得到6条WHSC1L1基因缺陷的纯合突变体,6条纯合体均为同一种突变类型,且突变类型为移码突变。通过设计高效率的sgRNA可以直接通过F_0代雌雄交配获得纯合突变体省去了F_0代与野生型交配确定突变率的步骤。本研究得到WHSC1L1基因缺陷的纯合体,为研究胚胎发育过程中由此基因突变引起的组蛋白甲基化修饰变化对胚胎发育的影响及机制提供了有力的帮助。

circ-WHSC1通过靶向作用于miR-338-3p/ELAVL1轴影响鼻咽癌细胞的生物学特征和放射敏感性

目的研究环状Wolf-Hirschhorn综合征候选基因1(circ-WHSC1)对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和放射敏感性的影响及分子机制。方法收集2017年1月至2020年6月于郑州大学附属郑州中心医院手术治疗的23例鼻咽癌患者的癌组织和癌旁组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测circ-WHSC1、miR-338-3p、果蝇胚胎致死视力异常样蛋白1(ELAVL1)mRNA的表达水平,Western blot检测ELAVL1蛋白的表达水平。将鼻咽癌细胞5-8F、SUNE1分为si-NC组、si-circ-WHSC1组、pCD5-ciR组、circ-WHSC1组、anti-miR-NC组、anti-miR-338-3p组、miR-NC组、miR-338-3p组、si-circ-WHSC1+anti-miR-NC组、si-circ-WHSC1+anti-miR-338-3p组、miR-338-3p+pcDNA组、miR-338-3p+ELAVL1组,采用四甲基偶氮唑蓝法检测细胞活性,克隆形成实验检测细胞克隆形成数及细胞放射敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,Western blot检测蛋白表达。采用双荧光素酶实验检测circ-WHSC1与miR-338-3p、miR-338-3p与ELAVL1的靶向关系。将稳定转染sh-circ-WHSC1的SUNE1细胞接种于裸鼠皮下,每隔3 d给予5 Gy红外线照射,23 d后测定移植瘤的体积和重量。结果鼻咽癌组织中circ-WHSC1和ELAVL1 mRNA的表达水平分别为3.78±1.18和3.36±0.77,高于癌旁组织(1.57±0.94和1.28±0.74,均P<0.001);miR-338-3p mRNA的表达水平为1.37±0.98,低于癌旁组织(3.13±0.96,P<0.001)。鼻咽癌细胞C666-1、6-10B、5-8F和SUNE1中circ-WHSC1 mRNA的表达水平分别为1.64±0.14、2.00±0.21、2.81±0.26和3.36±0.34,均高于鼻咽上皮细胞NP69(1.00±0.10,均P<0.05)。鼻咽癌细胞5-8F和SUNE1中miR-338-3p mRNA的表达水平分别为0.48±0.08和0.38±0.07,均低于鼻咽上皮细胞NP69(1.00±0.08,均P<0.001);ELAVL1蛋白的表达水平分别为2.51±0.19和3.27±0.27,均高于鼻咽上皮细胞NP69(1.00±0.08,均P<0.001)。与si-NC组比较,敲除circ-WHSC1后,鼻咽癌细胞的相对细胞活性降低[5-8F细胞:(51.33±8.62)%比(100.00±8.00)%;SUNE1细胞:(41.02±7.31)%比(100.00±10.10)%;均P<0.01],克隆形成数减少[5-8F细胞:(50.33±8.02)个比(101.00±8.54)个;SUNE1细胞:(42.33±10.01)个比(114.00±14.10)个;均P<0.01],细胞凋亡率升高[5-8F细胞:(18.3±1.01)%比(5.37±1.20)%;SUNE1细胞:(22.43±1.40)%比(6.50±1.18)%;均P<0.01],迁移数减少[5-8F细胞:(72.33±9.50)个比(136.00±13.00)个;SUNE1细胞:(62.67±11.50)个比(154.00±14.10)个;均P<0.01]、侵袭数减少[5-8F细胞:(60.67±9.07)个比(113.67±11.59)个;SUNE1细胞:(50.33±9.01)个比(124.33±15.57)个;均P<0.01];8 Gy射线照射后,细胞存活分数降低[5-8F细胞:0.06±0.01比0.23±0.04;SUNE1细胞:0.05±0.02比0.32±0.07;均P<0.05]。circ-WHSC1靶向负调控miR-338-3p的表达,抑制miR-338-3p可逆转敲除circ-WHSC1对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和放射敏感性的影响。miR-338-3p靶向负调控ELAVL1的表达,ELAVL1过表达可逆转上调miR-338-3p对鼻咽癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和放射敏感性的影响。裸鼠成瘤实验显示,与sh-NC组相比,细胞接种后23 d,sh-circ-WHSC1组小鼠肿瘤体积缩小[(487.33±76.51)mm^(3)比(884.67±95.63)mm^(3),P<0.001],肿瘤重量降低[(558.67±75.04)mg比(899.01±88.54)mg,P=0.002)];5 Gy红外线照射后,裸鼠肿瘤体积减小[(243.13±42.51)mm^(3)比(395.00±73.50)mm^(3),P<0.001],肿瘤重量降低[(211.09±57.51)mg比(452.33±67.30)mg,P=0.015]。结论鼻咽癌组织和细胞中circ-WHSC1高表达。circ-WHSC1通过靶向作用于miR-338-3p/ELAVL1轴影响鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭及放射敏感性。

NSD1与NSD2在神经干细胞发育过程中的不同角色

NSD (nuclear receptor binding SET domain containing)蛋白家族是一组较新发现的组蛋白甲基化转移酶,有三个成员:NSD1,NSD2(又名 MMSET和 WHSC1)和 NSD3(又名WHSC1L)。在很长一段时间里,NSD蛋白家族最受人们瞩目的焦点是它们与疾病的密切联系。NSD1,NSD2的单倍体不足分别导致了儿童期巨脑畸形综合征(Sotos syndrome)与沃尔夫综合症(Wolf-Hirschhorn syndrome),这些儿童分别有脑部生长过大,和过小的特征,并伴有不同程度的智力发育不全,神经系统的发育紊乱在这些疾病中扮演着至关重要的角色。本研究建立了小鼠胚胎干细胞体外诱导分化成神经干细胞的体系。并通过RT-PCR和Western blot方法检测 NSD1,NSD2在胚胎干细胞分化过程中的表达变化,观察到 NSD1, NSD2蛋白在小鼠胚胎干细胞中表达量极低,在RA诱导的神经干细胞形成过程中,表达量大幅度升高,其中 NSD1持续上升而 NSD2先升后降,这些结果与 NSD1, NSD2在神经系统发育中的重要作用以及相反的作用效果一致。另外,二者的蛋白水平与mRNA水平均有差异,尤其是NSD1的蛋白水平可能主要受到基因转录之外的机制调节。这个细胞体系对进一步研究 NSD1与 NSD2在神经发育过程中的作用机制具有重要意义。