基于WIPI1蛋白自噬检测方法及其在PCV2感染细胞自噬研究中的应用

多种病毒感染能够诱导细胞自噬,WIPI1蛋白是一种新发现的细胞自噬标记分子。为在PK-15细胞中建立基于红色荧光蛋白(Ds Red)与WIPI1融合表达蛋白的自噬检测方法,本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)感染为模式病毒,以药物处理作为阳性对照验证该方法的适用性。采用亚克隆策略构建了表达猪源WIPI1与Ds Red融合蛋白的真核重组表达质粒p Red-WIPI1,western blot检测显示Ds Red-WIPI1融合蛋白能够在PK-15细胞内表达,但不激活自噬标志分子LC3-II形成。然而,激光共聚焦分析显示,PCV2感染或自噬诱导剂Thapsigargin(Tg)及饥饿处理均能够显著促进WIPI1在细胞内形成点状聚集,并且促进Ds Red-WIPI1与EGFP-LC3的共定位。此外,荧光定量PCR结果显示,PCV2感染或Tg处理均能够显著上调wipi1的m RNA水平。本研究在稳定表达EGFP-LC3的PK-15细胞中建立了基于WIPI1蛋白的细胞自噬检测方法,该方法可以用于深入探索相关病毒感染诱导细胞自噬及其机制。

自噬相关WIPI1基因在结肠癌细胞中的表达及功能

目的:探讨细胞自噬相关WIPI1基因在结肠癌组织中的表达及其与结肠癌细胞功能之间的关系。方法:RT-PCR技术检测WIPI1基因在HCT116、SW60、RKO细胞中的表达。利用针对WIPI1基因的shRNA慢病毒感染人低分化结肠癌RKO细胞株,应用Celigo法检测WIPI1敲减对细胞增殖能力的影响;FACS检测WIPI1敲减对细胞周期阻滞能力的影响;Casepase3/7检测WIPI1基因敲减对细胞凋亡的影响;抗体芯片技术检测其可能影响的信号通路。结果:RT-PCR结果证实WIPI1基因在三株结肠癌细胞中表达丰度均为高表达。在基因沉默后,与对照组相比较,RKO细胞增殖受到显著抑制(P<0.05),且凋亡细胞数显著增加(P<0.05),细胞周期阻滞于S期;抗体芯片技术显示:细胞内信号通路中Stat3,Akt(Ser473),mTOR,p38,GSK-3β等相关分子显著下调。结论:沉默细胞自噬相关WIPI1基因对结肠癌细胞起到一定的抑制作用。

苦参碱诱导肝癌HepG2细胞自噬的作用与机制

目的探讨苦参碱对肝癌HepG2细胞自噬的作用,进一步研究苦参碱诱导HepG2细胞自噬的机制。方法将0.0(对照组)、0.4、0.8、1.6g·L^(-1)苦参碱及0.4g·L~(^(-1))苦参碱+10mmol·L^(-1)自噬特异抑制剂(3-MA)分别作用于肝癌HepG2细胞,构建体外模型。采用免疫印迹法(Western blotting)检测自噬基因LC3-Ⅱ的表达,实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)检测自噬基因WIPI1的表达,Annexin V FITC-PI流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率,电镜观察HepG2细胞自噬体变化与凋亡情况。结果 0.4、0.8、1.6g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞LC3-Ⅱ表达相比对照组均显著增加(P<0.05),其中0.4g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞LC3-Ⅱ表达水平最高;0.4g·L^(-1)苦参碱作用的HepG2细胞自噬体、WIPI1mRNA表达水平较对照组明显增加(P<0.05)。0.4g·L^(-1)苦参碱联合3-MA作用的HepG2细胞凋亡率较单纯0.4g·L^(-1)苦参碱作用的凋亡率显著增加(P<0.05)。结论苦参碱诱导HepG2自噬且减少细胞凋亡,与WIPI1的表达相关。自噬抑制剂可抑制苦参碱诱导的自噬,促进肝癌细胞凋亡,二者联合可成为临床治疗肝癌的新措施。