永生化人肝星状细胞株WM07的建立

目的以慢病毒载体介导猿猴病毒40(simian virus 40,SV40)大肿瘤抗原(large tumor antigen,TAg)转染原代人肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)获得永生化HSC株。方法以含SV40 TAg cDNA序列的SV40tsA58质粒为模板,PCR获取全长SV40 TAg序列,经TOPO克隆进入pENTR^(TM)TOPO~?载体,PCR鉴定获得pENTR-SV40 TAg Entrez质粒,再经LR重组反应将SV40 TAg cDNA克隆到目标慢病毒载体pLenti4/V5-DEST,PCR鉴定pLenti4/V5-GW/SV40 TAg质粒,进一步用该质粒转染工程细胞293FT进行假病毒包装,用含包装病毒的细胞培养上清液转染原代人HSC,经博来霉素筛选获得稳定表达SV40 TAg的人HSC株(命名为WM07),并对细胞进行SV40 TAg及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)表达的检测和鉴定。结果对pENTR-SV40 TAg Entrez质粒及pLenti4/V5-GW/SV40 TAg慢病毒表达质粒进行PCR测序,结果证实所构建的质粒含ATG转录起始位点及SV40 TAg cDNA序列。对经过转染、筛选获得的WM07行免疫荧光染色,结果显示SV40 TAg在细胞核表达和定位,细胞质内均表达活化的HSC标志物α-SMA。结论 pLenti4/V5-GW/SV40 TAg质粒构建成功。经质粒转染,获得永生化HSC株WM07,可稳定传代并用于肝纤维化研究。