转WMV-2外壳蛋白基因西瓜植株的病毒抗性

西瓜是夏季的重要水果 ,病毒病是影响其品质和产量的重要原因之一。植物基因工程的发展为抗病育种提供了新途径。利用外壳蛋白 (coatprotein)基因转化高等植物 ,赋予转基因植物以相应抗病性的成功例子已很多。本文报道WMV - 2CP基因在转基因西瓜植株中的遗传、分离、表达以及转基因植株对病毒病的抗性实验结果。通过自交结合PCR检测 ,发现WMV - 2CP基因在自交子一代的分离符合孟德尔 3∶1的分离比。经过连续 4代的选择鉴定 ,已从T7、T11和T32 3个独立转化子的后代中筛选获得 8个转基因纯合株系 ,性状表现整齐一致。Westernblot结果表明 ,R4 T7-1、R4 T11-3以及R4 T32 -73个不同来源的株系均能表达产生外壳蛋白。转基因纯合株系WMV - 2感染后的病毒抗性实验表明 ,与未转基因对照相比 ,转基因株系可以推迟发病时间 ,减轻发病程度。实验筛选获得的转基因株系R4 T32 -7表现出对WMV - 2的高度抗性 。

转WMV-2CP基因黄瓜植株的再生

以黄瓜无菌苗子叶切段为外植体 ,通过叶盘转化法与根瘤农杆菌进行共培养建立了黄瓜的转基因系统。农杆菌菌株为LBA44 0 4,内含双元载体pBPMWMV。该质粒载体带有一个npt Ⅱ基因 (筛选具有卡那霉素抗性的植株 )和一个WMV 2CP基因。抗卡那霉素 (Kanr)的黄瓜植株经DNA分子点杂交、PCR检测以及Southernblot证实 ,外源的WMV 2CP基因确实已导入黄瓜细胞且能稳定地遗传到子一代。对WMV 2CP基因在子一代的分离进行了统计。获得的转基因子一代植株对WMV 2表现出较强的抗性 ,可以延迟发病时间 。

转WMV-2CP基因甜瓜饲喂小鼠的安全性研究

转WMV-2CP基因甜瓜的小鼠急性和亚急性毒性试验、致突变试验以及30d喂养安全性分析试验.其小鼠经口急性毒性半致死量LD50>90g/kg体重试验,表明该转基因食品属实际无急性毒性物质;微核实验和精子畸变实验及Ames实验均未发现有致突变作用;30d喂养试验,54、108、162g/kg体重各剂量组小鼠发育、增重、食物利用率、血常规、脏体比及病理组织学等各项指标和基础对照组比较均无显著性差异.上述结果初步表明转WMV-2CP基因甜瓜对小鼠没有毒性,属安全食品.

转WMV-2 CP基因西瓜的安全性评价

以转WMV-2CP基因西瓜(Citrullus lanatus var. lanatus)为例,对转基因食品进行了安全性评价。对转WMV-2CP基因西瓜进行小鼠急性和亚急性毒性试验、致突变试验以及30 d喂养试验。结果表明,小鼠经口急性毒性半数致死量LD50>150 g.kg-1,属实际无急性毒性物质;经微核实验、精子畸变实验及Ames实验均未发现有致突变作用;30 d喂养试验,90 g.kg-1、180 g.kg-1、270 g.kg-1各剂量组小鼠发育、增重、食物利用率、血常规、脏体比及病理组织学观察等各项指标与基础对照组比均无显著性差异。初步表明转WMV-2CP基因西瓜对小鼠没有毒性,属安全食品。

转WMV-2CP基因西瓜中间试验的农艺性状评价

为研究转WMV-2CP基因浙密2号西瓜及野生型在农艺性状方面是否存在差异,提供转基因浙密2号西瓜的环境安全性评价数据,本研究对供试材料部分农艺性状进行统计学分析。结果表明,转WMV-2CP基因浙密2号西瓜与受体品种在长势、生物学性状、含糖量、越冬能力等性状上没有显著差异,而抵抗病毒的能力得到了显著提高。

WMV-2感染引起甜瓜植株苯丙氨酸解氨酶和叶绿素的变化

研究了西瓜花叶病毒-2新疆株(Watermelon mosaic virus-2-XJ,WMV-2-XJ)感染抗性不同的甜瓜品种后苯丙氨酸解氨酶和叶绿素含量的变化.与健康对照植株相比,受感染植株的酶活性均有所增高,但抗性品种“新玉”增高的幅度是感性品种“网纹香”的2倍,酶活性峰早出现12天,即抗性品种酶活性增高幅度大,酶活性峰出现早,叶绿素的变化则与抗性呈负相关,抗性品种“新玉”受WMV-2-XJ感染后的叶绿素含量与健康对照差异不大,而感性品种“网纹香”的叶绿素含量则比健康对照下降了62.9%.苯丙氨酸解氨酶和叶绿素含量的变化均与甜瓜品种对WMV-2-XJ的抗性呈现规律性的相关性,这种规律性可用于甜瓜品种对WMV-2-XJ抗性鉴定的生物化学分析.

罗汉果花叶病毒(WMV-2-Luo)抗血清制备及ELISA检测技术研究

用西葫芦作为罗汉果花叶病毒 (WMV 2 Luo)的繁殖寄主 ,通过差速离心和PEG二次沉淀法得到WMV 2 Luo的提纯液 ,用该病毒提纯液免疫日本大白兔 ,获得了WMV 2 Luo兔抗血清。经ELISA测定 ,其效价为 1/5 12 0 ,以 0 1mol/L磷酸盐缓冲液 (pH7 8,含 1 5 %NaDIECA)作为样品制备缓冲液 ,用间接ELISA法检测WMV 2 Luo的灵敏度为 1/32 0 0。用此方法检测罗汉果组培苗带毒情况和田间病株均获得成功。

西瓜花叶病毒2号(WMV-2)对棉蚜生物学特性的影响

通过对棉蚜寄主选择、显微测量、解剖法及室内培养,研究了西瓜花叶病毒2号对棉蚜寄主甜瓜的趋向性、体长、胚胎数量、繁殖力等的影响。结果表明,棉蚜嗜好感病的甜瓜;病株上棉蚜胚胎数目比健株多2～3个;病株上棉蚜的体长大于健康株;用Logistic曲线拟合,病株上棉蚜最大生物容纳量和瞬时增加速率大于健株;在寄主甜瓜接毒2周内,病株上棉蚜个体繁殖力大于健株,但接毒2周后,病株上棉蚜的繁殖力小于健株;病毒WMV-2对棉蚜种群结构也有影响。

西瓜花叶病毒-2新疆株的桃蚜传播特性的研究

研究了桃蚜传播西瓜花叶病毒-2新疆株(WMV-2-X J)的规律,结果表明,无毒蚜虫能够获毒的最短取食时间为30 s,获毒率随取食时间的延长而提高,取食时间为70 s以上时,获毒率达100%;带毒蚜虫传毒的最短取食时间为0.25 h,当取食时间超过最短传毒时间时,传毒率随取食时间的增加而升高,取食时间达2h以上时,传毒率达100%;带毒蚜虫能够传毒的最少头数为1头,传毒率随单株植物带毒蚜虫数目的增加而升高,单株虫量达15头以上时,传毒率达100%.说明桃蚜可以高效率地传播西瓜花叶病毒-2新疆株.

西瓜花叶病毒(WMV—2)两株系寄主的病生理研究

以沈阳农大植保系植物病毒研究室提供的WMV—2两株系WMV—2(1)和WMV—2(2)为试材。它们除寄主范围及在某些指示植物上有症状反应的差异外,亦导致其寄主的病生理反应不同。如接种到西葫芦叶片后,株系的强弱差别亦能反应到叶片叶绿素含量多少、光合作用强度、电导率及过氧化物同工酶活性等指标上。试验初步观察到WMV—2的两个株系其寄主病生理上,存在某些可以分辨的差异,WMV—2(1)对西葫芦叶片内叶绿素的破坏程度、降低光合强度以及过氧化物酶活性升高的程度等均大于WMV—2(2)。由此,作者等初步认为这些病生理指标可作为区分西瓜花叶病毒株系较好的辅助手段。

西瓜花叶病毒2号南瓜分离物的鉴定及其外壳蛋白基因序列分析

利用电镜和酶联免疫吸附测定法(ELISA)在黑龙江省采集的南瓜病样中检测到西瓜花叶病毒2号(WMV-2)。再利用免疫PCR(IC-PCR)和反转录PCR(RT-PCR)方法,扩增获得其外壳蛋白(CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,该分离物CP基因全长为852个核苷酸,编码由284个氨基酸组成的31.8 kDa蛋白。与国外已报道的WMV-2 CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.2％-94.O％,由此推导的氨基酸序列同源性为94.5％-98.1％。与国内2个分离物相比,和山西分离物核苷酸和氨基酸的同源性都达到98.5％,和郑州分离物核苷酸和氨基酸的同源性分别为91.5％和95.0％。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳病毒衣壳蛋白快速诊断瓜类作物上的三种病毒Ⅰ

本试验以发生在我国葫芦科作物上的三种主要病毒WMV—2,CMV和SqMV为研究对象,尝试用病毒衣壳蛋白亚基的SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳诊断瓜类作物病毒。试验结果说明,对病株叶片或其他组织进行初步的澄清和病毒浓缩处理,可以检测出病毒衣壳蛋白亚基谱带。根据病毒衣壳蛋白亚基的分子量差异,可以区别这三种病毒。这种方法有其他常规诊断方法(包括生物学测定,电镜观察和血清学方法等)所不具有的优点。病毒浓度的检测限度在1—50μg/ml水平。

农杆菌法转化获得转基因西瓜植株

西瓜子叶外植体能被含双元载体 p BPMWMV的根瘤农杆菌感染 .该质粒载体含有一个 npt- 基因以供选择 Kanr的转基因西瓜植株以及一个 WMV- 2 CP基因 . Kanr西瓜植株经 NPT- 酶活性检测、DNA分子点杂交及 Southern杂交试验证明 ,外源的 WMV- 2 CP基因已导入西瓜细胞 .

南瓜病毒病的研究进展

综述了南瓜病毒病的主要毒原 ,黄瓜花叶病毒 (CMV)、西瓜花叶病毒 2号 (WMV- 2 )、番木瓜环斑病毒 (Pa RSV)、南瓜花叶病毒 (Sp MV)、小西葫芦黄化花叶病毒 (ZYMV)、中国南瓜曲叶病毒 (SLCV)的生物学特性、抗源。

西瓜花叶病毒的研究进展

综述了西瓜花叶病毒的生物学特性、血清学、抗源及在抗病毒基因工程策略方面的研究进 展,为抗病育种提供更为可靠的理论依据。

罗汉果组培苗脱毒方法研究

采用热处理结合茎尖技术对罗汉果组培苗进行脱毒培养，并用间接酶联免疫法和电镜观察法对脱毒效果进行检测．结果表明．组培苗经38．5℃热处理10d后，剥取0．2～0．5mm微茎尖培养或切取1．0～1．5mm茎尖进行二次茎尖脱毒培养，茎尖苗的脱毒率均为100％，建立了两种有效的罗汉果组培苗脱毒方法。

罗汉果茎尖脱毒技术研究

以罗汉果组培苗为试材,在高温热处理不同天数后剥取茎尖,进行罗汉果花叶病毒脱毒技术研究,同时采用间接ELISA法和电镜观察法检测其脱毒效果。结果表明:适合罗汉果热处理的时间为7～15d,试管苗的成活率可达90%～100%;38.5℃热处理10d剥取0.2～0.5mm的茎尖进行培养,脱毒率为100%。

罗汉果组培苗二次脱毒技术研究

对罗汉果(Siraitia grosvenorii)组培苗采用热处理和剥取茎尖技术进行二次脱毒处理,脱毒效果采用间接酶联免疫法和电镜观察法进行检测。结果表明,适合材料热处理的培养基为MS+0.3 mg/L 6-BA+NAA 0.1 mg/L+0.1 mg/L IBA,热处理材料的顶芽呈锥形,利于剥取茎尖;茎尖分化最佳培养基为MS+0.3 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3;38.5℃热处理10 d剥取长1.0～1.5 mm的茎尖进行二次脱毒培养,存活率为80.00%,脱毒率为100.00%。

西瓜抗病毒病材料的抗性鉴定和筛选研究

对35份来源于山西金鼎生物种业股份有限公司的西瓜资源进行了人工苗期接种西瓜花叶病毒2号(WMV-Ⅱ)和西葫芦黄化花叶病毒(ZYMV)的鉴定筛选,结果表明,V-7、V-15、V-26和V-31等4份材料表现抗病(或耐病),可望在育种上进一步利用。