WNK2通过抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路延缓肝细胞癌的增殖和侵袭

目的探讨WNK2对肝细胞癌(hepatocellocellua carcinoma,HCC)中ERK1/2/ROS/SHP2信号通路的影响,并探讨其在HCC细胞增殖和迁移中的作用。方法将WNK2-mimic和sh-RNA WNK2以及相应的阴性对照转染HepG2细胞,采用BALB/c裸鼠皮下成瘤实验检测WNK2对肝细胞癌增殖能力的影响;采用Western Blot检测瘤组织中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用SHP2抑制剂PHPS1进行处理之后,采用Western Blot检测HepG2细胞中WNK2、p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达;使用细胞划痕实验和Transwell检测HepG2细胞的迁移能力和侵袭能力;采用单克隆增殖实验和CCK-8检测HepG2细胞的增殖能力。结果与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组裸鼠的瘤体体积显著增大(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组裸鼠的瘤体体积显著减小(P<0.01);Western Blot结果显示,与sh-NC组相比,sh-RNA WNK2组WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);而与NC-mimic组相比,WNK2-mimic组WNK2的表达显著升高(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著降低(P<0.01);在体外实验当中,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.01);相对于sh-NC+PHPS1组,sh-RNA WNK2+PHPS1组中WNK2的表达显著降低(P<0.01),而p40、gp90、p-SHP2、p-AKT和p-ERK1/2的表达则被逆转并且与sh-NC+PHPS1组不具有显著性差异(P>0.05);细胞划痕实验和Transwell结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著升高(P<0.01);sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的迁移和侵袭能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05);单克隆增殖实验结果显示,相对于sh-NC组,sh-RNA WNK2组HepG2细胞的增殖能力显著升高(P<0.01),而sh-NC+PHPS1组和sh-RNA WNK2+PHPS1组HepG2细胞的增殖能力显著降低并且不具有显著性差异(P>0.05)。结论WNK2可以抑制ERK1/2/ROS/SHP2信号通路,从而抑制ERK1/2/AKT信号通路,延缓HCC的增殖和迁移。

Gordon综合征患者WNK基因突变研究

目的:通过对Gordon综合征(PHA2)患者的WNK4和WNK1基因外显子扩增测序,研究我国PHA2患者WNK基因的突变特点。方法:通过查阅住院病史,收集不明原因高血压伴高血钾而肾功能正常的患者,进行临床和实验室检查,确诊PHA2。采集患病者及患病/非患病亲属的外周血,抽提DNA,设计17对引物扩增WNK4的19个外显子,27对引物扩增WNK1的28个外显子,纯化后送测序,测序结果进行序列比对。结果:发现PHA2患者4例,其中2例表现为家族遗传性,另2例为散发。先证者及所有患病家系成员共8人,年龄6～79岁,均表现为不明原因的高血压、高血钾,肾功能正常。8例中的5例伴有肾小管酸中毒,6例伴有高氯血症。DNA扩增后测序比对发现,其中1例散发患者为WNK4基因的杂合错义突变,位于17号外显子,造成氨基酸序列的改变,赖氨酸突变为谷氨酸(K1169E)。对其2个非患病女儿以及200个正常对照的WNK4基因检测均未发现该突变。其它2个患病家系及1个散发患者未发现WNK4基因突变,所有患者和健康者均未发现WNK1外显子突变。结论:PHA2是一种少见的单基因遗传疾病,漏误诊率很高。已报道的WNK4致病位点均位于螺旋-螺旋结构域附近。我们发现的K1169E为HGMD未收录的新突变,也位于螺旋-螺旋结构域,该位点氨基酸在不同物种高度保守,而且该位点氨基酸的变化伴有电荷的改变,可能导致蛋白质构象的改变。

WNK1基因多态性与血管紧张素转换酶抑制剂降压疗效的相关性研究

目的探讨缺乏赖氨酸的丝氨蜃受／苏氨酸蛋白激酶1（WNK1）基因单核苷酸多态性与血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）降压疗效的相关性。方法选取新发的轻中度原发性高血压病患者121例，均来自北京市昌平地区的常住汉族人群。予以贝那普利口服治疗8周，对降压疗效进行评定。利用TaqManMGB等位基因分型试剂盒检测患者WNK1基因多态性rs880054和rs2301880的分布频率。结果患者rs880054位点和rs2301880位点不同基因型的降压疗效间差异有统计学意义（P〈0．05）。rs880054位点不同基因型的舒张压（DBP）降低幅度间差异有统计学意义（P〈0．05），收缩压（SBP）降低幅度间差异无统计学意义（P〉0．05）；rs2301880位点不同基因型的DBP降低幅度间差异有统计学意义（P〈0．05），SBP降低幅度间差异无统计学意义（P〉0．05）。rs880054位点不同基因型与经ACEI治疗后DBP的降低幅度有关（R^2=0．167，P〈0．001）；rs2301880位点不同基因型同样与治疗后DBP的降低幅度有关（R^2=0．080，P=0．003）；未发现上述两位点与SBP降低幅度的相关性。结论WNK1基因单核苷酸多态性可能与ACEI的降压疗效有关。

WNK4基因与原发性高血压的相关性分析

目的 探讨WNK4基因突变与原发性高血压的关系及WNK4基因的表达分析。方法 通过测序在小样本中找到cSNP,然后利用PCR-RFLP方法检测98例原发性高血压患者和95例健康对照者该位点多态。应用RT-PCR方法对WNK4基因进行表达分析。结果 发现了WNK4基因第七外显子G1662A的1个cSNP,且其等位基因频率在原发性高血压组和健康对照组中存在显著性差异。WNK4基因表达分析显示WNK4基因在胎儿肾脏、脑、肺、心、脾、肠等组织中均有表达。结论 WNK4基因与原发性高血压密切相关。

WNK_3激酶高表达对白介素-1β诱导HEK293细胞凋亡的保护作用

目的:观察WNK_3激酶高表达对白介素-1β(IL-1β)诱导人胚肾细胞(HEK293细胞)凋亡的作用。方法:HEK293细胞分为3组:Vector+NS组、Vector+IL-1β组和WNK_3+IL-1β组。Vector+NS组、Vector+IL-1β组转染对照Vector,WNK_3+IL-1β组转染WNK_3。药物干预时,Vector+NS组加入等量0.9%氯化钠溶液,Vector+IL-1β组、WNK_3+IL-1β组加入10 ng/m L IL-1β。分别于培养0、12、24、36和48 h时,采用CCK-8试剂盒检测细胞活性。孵育0、18、36 h时应用Western blot法检测Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9等凋亡蛋白。在IL-1β干预0、30、60 min时采用Western blot法检测JNK通路蛋白。结果:Vector+IL-1β组在给药后细胞活性逐渐下降,在48 h达到最低值,WNK_3+IL-1β组下降幅度较缓和,与同时间点Vector+IL-1β组比较细胞活性回升,在48 h时差异有统计学意义(P<0.01)。IL-1β孵育后cleaved Caspase-3和cleaved Caspase-9表达量增加。与36 h的Vector+IL-1β组比较,WNK_3+IL-1β组的cleaved Caspase-3显著减少,2组的cleaved Caspase-9在18 h及36 h时差异亦存在统计学意义(P<0.05)。WNK_3转染后p-JNK的表达水平较未转染WNK_3组的上升幅度降低(P<0.05)。结论:IL-1β诱导HEK293细胞活性下降,而转染WNK_3质粒可以有效逆转部分细胞活性。WNK_3激酶通过减少JNK的磷酸化抑制Caspase途径的活化,减少细胞凋亡,起到在不利条件下保护肾脏细胞的作用。

Wnk1基因多态性与汉族人缺血性卒中的关联分析

目的：探索赖氨酸缺乏蛋白激酶1（Wnk1）基因单核苷酸多态性（SNP）与中国汉族人群缺血性卒中的关系.方法：收集2008年1月～2009年12月新疆5所医院294例汉族缺血性卒中患者（病例组）和同期外科系统住院治疗的其他无脑梗死疾病的汉族患者314例（对照组）进行病例对照研究.用标签SNP（tSNP）策略选择Wnk1基因10个SNP位点（rs3858703、rs11611246、rs7305065、rs1990021、rs34408667、rs12309274、rs1012729、rs956868、rs12828016、rs953361）.SNP基因分型检测采用多重SNaPshot平台.用t检验、卡方检验和logistic回归分析对数据进行统计分析,用Haploview软件进行连锁不平衡分析和单倍型分析.结果：病例组饮酒（37.1%）、高血压病（62.9%）、糖尿病（18.0%）、高脂血症（36 4%）患者比例均高于对照组（均P〈0.01）,而吸烟者比例在两组间差异无统计学意义（P〉0 05）.所有位点基因分型缺失率均在1%以下.除rs34408667位点外,其余tSNP均通过Hardy-Weinberg平衡检验.Wnk1基因第四内含子rs11611246位点与汉族缺血性卒中相关.T等位基因在病例组中的分布频率低于对照组（30 3%与35 7%,P=0.046）.进行性别分层后发现,rs11611246 T等位基因是汉族男性缺血性卒中发病的保护因子.GT基因型及TT基因型在病例组男性中的分布频率分别为43.3%及7.2%,而在对照组男性中的分布频率分别为43.1%及15.2% （P=0.038）.加性遗传模型显示T等位基因携带者发生缺血性卒中的风险是对照组的0.702倍（95%CI：0.517~0.953,P=0.023）.调整年龄后差异仍然存在（P=0.022）,进一步调整年龄、体质量指数、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、高脂血症等混杂因素后,差异仍然存在（P=0.008）.未发现Wnk1基因其余9个SNP位点与汉族人脑梗死相关.结论：Wnk1基因第四内含子rs11611246多态性影响中国人缺血性卒中的发生.rs11611246位点T等位基因可能是汉族男性发生缺血性卒中的保护因素.

高钾饮食对大鼠肾脏WNK 1不同转录本表达的作用及其意义

背景 WNK1是新近发现的肾脏多个离子转运体及通道的调控蛋白,与醛固酮离子转运途径有关。目的探讨高钾饮食致体内醛固酮增高对大鼠肾脏 WNK1不同转录本表达的作用及其意义。方法采用高钾饮水饲养 Wistar 大鼠8只,检测血清、24 h 尿液离子质量浓度及血清醛固酮质量浓度。半定量 RT-PCR 方法检测大鼠肾脏 WNK1-L和 WNK1-KS 基因表达情况。结果与正常对照组(n=8)比较,高钾组(n=8)血清醛固酮水平显著升高[(1.86±0.66)比对照组:(0.25±0.04)μg/L,P<0.01],为对照的7.4倍。血清及尿液钾离子和尿液氯离子质量浓度升高(P<0.05),尿液钠离子质量浓度下降(P<0.05),血清钠离子和氯离子无差异(P>0.05)。高钾组WNK1-L 表达量无差异(0.27±0.07比0.26±0.07,P>0.05),WNK1-KS 表达量显著上升(1.60±0.22比0.38±0.08,P<0.01)。结论高钾饮食导致大鼠醛固酮质量浓度升高,醛固酮可通过调控 WNK1-KS 表达起到排钾保钠的生理作用。

WNK4基因单核苷酸多态性与原发性高血压相关性研究进展

原发性高血压（Essential hypertension,EH）是遗传因素和环境因素共同作用的结果,家族和流行病学研究显示30%～50%的EH患者受遗传因素的影响[1-2]。目前对EH的分子致病机制还所知甚少。高血压相关基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNPs）的筛查及关联分析,是研究高血压候选基因及其功能的主要手段之一。

WNK1基因rs11611246位点多态性与云南汉族儿童急性淋巴细胞白血病关联性研究

目的:分析云南汉族人群急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿WNK1基因rs11611246位点多态性,并探讨此基因位点多态性与ALL发病关系。方法:选择昆明医科大学第一附属医院2012年1月~2014年1月收治的首诊ALL患儿86例为研究对象,另选择同期健康患儿95例为健康对照组,收集相关资料,采用TaqMan-MGB探针等位基因分型技术分析rs11611246位点多态性,免疫印迹法检测ALL患者骨髓WNK1蛋白表达,并进行统计学分析。结果:ALL患儿与健康儿童rs11611246位点GG型、GT型、TT型等位基因均符合Hardy-Weinberg遗传平衡规律,GG型基因会显著增加儿童ALL患病风险(OR:2.002,95%CI:1.517~2.853,P=0.012),合并分析后发现G等位基因ALL发病风险是T等位基因2.189倍(95%CI:1.583~2.971,P=0.008)。GG型基因与“出生后居室装修”、“放射性物质接触”有协同交互作用(P<0.05)。GG型、GT/TT型患儿第1疗程诱导治疗完全缓解率无显著差异,但是GG型患儿5年无复发生存率、5年无事件生存率及5年总生存率显著低于GT/TT型患儿(P<0.05)。GG型患儿骨髓细胞WNK1蛋白表达显著低于GT型、TT型(P<0.05)。结论:WNK1基因rs11611246位点多态性与儿童ALL易感性相关,与部分环境因素呈协同交互作用,对患儿预后有一定影响。

低钾失盐性肾小管病患者WNK基因突变研究

目的通过对低钾失盐性肾小管病(SLTs)家系WNK基因外显子扩增测序,初步探讨SLTs的分子遗传学机制。方法以经CLCNKB和SLC12A3基因测序不符合典型Bartter综合征或Gitelman综合征基因型的8个SLTs家系为研究对象,抽提患者及患病/非患病亲属的外周血DNA,设计引物扩增WNK4和WNK1的外显子序列,送测序并进行序列比对。结果对8个SLTs家系的WNK基因扫描发现2个WNK1杂合错义突变,分别为Ile1172→Met(I1172M)和Ser2047→Asn(S2047N),且仅存在于家系患病者中,非患病家族成员及正常对照中均未检出。结论在8个SLTs家系患病者中发现2个伴氨基酸改变的WNK1杂合突变(I1172M和S2047N),提示WNK激酶可能是非婴儿期SLTs的第三个致病基因。

WNK1基因单核苷酸多态性位点与高血压患者左心室质量指数的相关性研究

目的:探讨缺乏赖氨酸的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(WNK1)基因单核苷酸多态性位点rs956868与高血压患者左心室质量指数的相关性。方法:新发的轻中度原发性高血压患者121例,均来自北京市昌平地区的常住汉族人群,予以超声心动图检查,利用TaqMan MGB等位基因分型试剂盒检测患者WNK1基因多态性rs956868的分布频率。结果:rs956868位点(CA+AA)基因型患者的左心室质量指数显著高于CC基因型患者〔(86.46±26.35)vs.(77.16±20.64),P=0.046〕。用多元逐步回顾分析,校正年龄、性别、体质量指数、吸烟、饮酒、血压、血糖及血脂水平后,rs956868位点基因型仍与左心室质量指数具有相关性,它和性别、年龄、BMI一起与高血压患者左心室质量指数变异的34.3%有关(R2=0.343,P=0.026)。结论:WNK1基因单核苷酸多态性位点可能与高血压患者左心室肥厚的易感性有关。

WNK2及MEK-1、ERK1/2在散发性结肠管状腺瘤癌变过程中的表达及意义

目的探讨WNK2、MEK-1和ERK1/2在散发性结肠管状腺瘤癌变过程中的可能作用。方法采用免疫组织化学方法检测112例散发性结肠管状腺瘤伴不同程度异型增生及癌变组织中WNK2、MEK-1和ERK1/2在蛋白水平的表达情况。结果 WNK2蛋白在正常结肠黏膜、结肠管状腺瘤伴异型增生及腺瘤癌变组中阳性表达率逐渐降低(P<0.05),分别为100%、70%和42.86%,而MEK-1及ERK1/2蛋白阳性表达率明显升高,且异型增生组和癌变组中MEK-1和ERK1/2的蛋白阳性表达率均明显高于正常结肠黏膜组(P<0.05)。WNK2蛋白的表达随结肠管状腺瘤异型增生程度的增高而降低,而MEK-1和ERK1/2的蛋白阳性表达随结肠管状腺瘤异型增生程度的增高而升高(P<0.05)。WNK2与MEK-1及与ERK1/2间存在负相关关系(r=-0.372,r=-0.371,P<0.05)。MEK-1与ERK1/2存在正相关关系(r=0.475,P<0.05)。结论 WNK2可能通过负向调节MEK-1及ERK1/2促进散发性结肠管状腺瘤的形成及癌变的发生。

WNK4基因Ala589Ser多态在原发性高血压发病中作用的探讨

目的探讨WNK4基因Exon8Ala589Ser多态与原发性高血压的关系。方法259例原发性高血压患者和235例健康对照组人群血样应用PCRRFLP方法检测WNK4基因Exon8Ala589Ser多态,结果经测序验证,同时检测所有人群的血糖、血脂等生化指标。进一步应用Logistic回归分析各种临床生化指标及该多态与高血压的危险关系。结果原发性高血压组与健康对照组WNK4基因Exon8Ala589Ser多态基因型比较无明显差异(P>0.05),但两组等位基因频率比较具有显著性差异(P<0.05)。Logistic分析显示异常的胆固醇、低密度脂蛋白水平及WNK4基因Exon8Ala589Ser多态T等位基因携带者高血压患病危险显著增高。结论WNK4基因Exon8Ala589Ser多态与原发性高血压密切相关,T等位基因是高血压的独立危险因素,可能参与了原发性高血压的发病过程。

中国东北汉族人群WNK4基因多态性与原发性高血压的关联性

目的探讨东北汉族人群WNK4基因多态性与原发性高血压的关系。方法259例原发性高血压患者和235例健康正常对照人群血样应用PCR-RFLP方法检测A589S多态,结果经测序验证,同时检测所有人群的血糖、血脂等生化指标。结果(1)两组研究对象基因型频率间差别无显著性意义(P>0.05),但等位基因频率间差别有显著性意义(P<0.05);(2)GT和TT基因型与收缩压及舒张压升高密切相关(P=0.041,0.032)。结论WNK4基因A589S多态可能与高血压密切相关。

WNK激酶的研究进展

WNK家族是近年来新发现的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,因其激酶结构域第2亚单位上缺乏其他激酶所具有的用来结合ATP的赖氨酸残基而得名。哺乳动物的4种WNK激酶都由氨基端结构域,高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域,自抑制结构域和至少两个螺旋-螺旋结构域组成。WNK1基因第一内含子的大片段缺失和WNK4螺旋-螺旋结构域一段高度保守区域的错义突变,可导致Gordon综合征,进一步研究发现WNK激酶能调节肾小管多种离子转运蛋白和离子通道,以维持电解质平衡。它不仅是遗传性高血压Gordon综合征的致病基因,而且可能参与原发性高血压的发病。此外,WNK激酶还与信号转导,细胞生长、凋亡和胚胎发育有关。

MiR-338-3p通过靶向WNK1影响食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的机制研究

目的探讨miR-338-3p影响食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的分子机制及其对WNK1的靶向调控作用。方法体外培养人正常食管上皮细胞株Het-1A与人食管癌细胞Eca-109、EC-1、EC9706,采用q RT-PCR与Western blot分别检测miR-338-3p、WNK1的表达水平;以EC9706细胞为研究对象,分别将miR-con、miR-338-3p mimics、si-con、si-WNK1、miR-338-3p mimics与pc DNA、miR-338-3p mimics与pc DNA-WNK1转染至EC9706细胞;MTT法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、Transwell小室实验检测迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告实验检测miR-338-3p与WNK1的靶向关系。结果与Het-1A比较,食管癌细胞Eca-109、EC-1、EC9706中miR-338-3p的表达显著下调(P<0.05),WNK1 m RNA及蛋白表达显著上调(P<0.05);转染miR-338-3p mimics或si-WNK1可明显降低EC9706细胞的活力、迁移及侵袭细胞数(P<0.05),增加EC9706细胞的凋亡率(P<0.05);双荧光素酶报告实验证实miR-338-3靶向结合WNK1;共转染miR-338-3p mimics与pc DNA-WNK1可明显逆转转染miR-338-3p mimics对细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的作用。结论miR-338-3p可靶向下调食管癌中的WNK1,进而抑制食管癌细胞的增殖、迁移及侵袭,和诱导细胞凋亡。

WNK1基因不同转录本在小鼠肾脏中的表达及意义

目的 研究WNK1基因长短两个转录本在小鼠肾脏组织中的表达分布特征 ,为进一步研究它们的生物学功能提供实验数据。方法 RT PCR扩增两个转录本的特异性片段 ,Northern印迹杂交证实片段特异性后 ,将片段克隆入pGEM T载体中 ,体外转录同位素标记的正义和反义RNA探针 ,在小鼠肾脏组织石蜡切片上进行原位杂交检测。结果 WNK1基因长转录本微弱广泛地表达在小鼠肾脏组织上 ,短转录本特异地表达在小鼠肾脏皮质部的远曲小管上。结论 在肾脏 ,WNK1基因的短转录本是功能性转录本 ,其编码的蛋白质在生物学功能上可能与其它激酶不同。

WNK1基因Pro1056Thr多态与高血压病的关联研究

目的探讨WNK1基因Exon13 Pro1056Thr多态是否与高血压病有关。方法为研究WNK1基因多态与原发性高血压的相关性,我们通过病例对照研究在河南省信阳市农村入选高血压病患者820例,正常对照772例。应用PCR-RFLP方法检测WNK1基因Exon13 Pro1056Thr多态性,结果经测序验证。应用Logistic回归分析该多态与高血压病的关联性。结果WNK1基因Exon13 Pro1056Thr与高血压病的易感性显著相关(优势比1.42,95%可信区间1.16～1.74,P=0.001),应用logistic回归校正传统危险因素后,这一关联性依然存在(优势比1.39,95%可信区间1.10～1.77,P= 0.007)。WNK1基因Exon13 Pro1056Thr A等位基因携带者增加高血压病的易感性。结论WNK1基因Exon13 Pro1056Thr多态与高血压病密切相关,A等位基因是高血压病的独立危险因素。因而,WNK1基因可能参与了高血压病的发病过程。