外源性抑制Wnt信号通路对BMP-2诱导的人牙髓细胞向成牙本质分化的影响

目的探讨外源性抑制Wnt信号通路对骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的人牙髓细胞(HDPC)向成牙本质分化的影响。方法将HDPC随机分为对照组、单纯诱导组、抑制剂处理组,对照组不处理,单纯诱导组采用BMP-2诱导液处理,抑制剂处理组采用Wnt抑制剂DKK-1及BMP-2诱导液处理。采用蛋白免疫印迹技术检测各组细胞核β-catenin蛋白表达,PNPP偶氮法检测各组细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,Von Kossa染色检测钙结节数量,实时荧光定量PCR与蛋白免疫印迹技术检测各组细胞中牙本质基质蛋白(DMP-1)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)表达。结果与对照组相比,单纯诱导组、抑制剂处理组中HDPC细胞核β-catenin蛋白表达下调(P均<0. 05),而ALP活性、钙化结节数量、DSPP和DMP-1 mRNA与蛋白表达均上调(P均<0. 05)。与单纯诱导组相比,抑制剂处理组中HDPC细胞核β-catenin蛋白表达下调(P <0. 05),同时ALP活性、钙化结节数量、DSPP和DMP-1 mRNA与蛋白表达上调(P均<0. 05)。结论外源性抑制Wnt信号通路,可促进BMP-2诱导HDPC分化为成牙本质细胞。

Wnt家族成员在TA2小鼠乳腺癌生成过程中基因表达变化规律

目的:研究乳腺癌生成过程中,Wnt家族成员表达的变化规律。方法:收集自发乳腺癌小鼠42只,记录其详细资料。采用基因芯片筛选正常TA2小鼠乳腺组织和自发乳腺癌TA2小鼠乳腺癌组织中的差异表达基因,随后用Real-time PCR进行验证,并检测TA2小鼠乳腺癌形成过程中相关基因表达的变化。结果:TA2自发乳腺癌小鼠平均见瘤年龄为(336.706±85.05)d,平均分娩次数为(3.767±1.79)次。分娩次数最多者为7次,其平均见瘤年龄只有251.5 d。TA2小鼠基因芯片结果发现Wnt家族成员中,Wnt1、Wnt10b、Wnt5a、Wnt5b在正常乳腺组织和乳腺癌组织中表达具有差异。Real time PCR的结果证实了以上结果,并发现Wnt1、Wnt10b、Wnt5a在癌前病变和乳腺癌组织中表达高于正常乳腺组织,而Wnt5b在乳腺癌组织中表达低于正常乳腺组织。结论:Wnt1、Wnt5a、Wmt10b在TA2小鼠乳腺癌生成过程中起促进作用,而Wnt5b的作用可能是抑制小鼠乳腺癌的生成。

苏博美利奴羊胚胎期WNT2基因的组织表达及其生物信息学预测分析

【目的】检测WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135 d不同组织中的表达水平,了解WNT2基因的分子结构和进化特征,从分子水平及进化特征上研究苏博美利奴羊的组织器官与WNT2基因表达之间的内在联系,为筛选细毛羊毛囊发育相关候选基因提供理论依据。【方法】采用qRT-PCR法研究苏博美利奴羊毛囊成熟时期WNT2基因在不同组织中的表达,并使用PROMO软件预测WNT2基因启动子区域序列的转录因子,并用Cytoscape_v3.5.1软件可视化,使用MEGA 7.0软件分析WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分及密码子的偏好性,并且利用绵羊、山羊、牛、人等9个物种的WNT2基因的DNA序列构建系统进化树。【结果】WNT2基因在皮肤组织中的表达量极显著高于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织。在绵羊WNT2基因启动子区域序列共预测出101个相关转录因子,4种碱基呈现均匀分布,CAG与UCU是使用相对较多的密码子,对WNT2基因的DNA序列系统进化树分析发现山羊和绵羊之间的进化关系比与其他哺乳动物进行比较时更为接近。【结论】建立了胚胎期135 d的苏博美利奴羊的不同组织中WNT2基因表达量的RT-PCR方法,并使用生物信息学软件对其分子结构和进化特征进行分析。

LATS2基因通过Wnt信号通路对H9C2心肌细胞保护的作用机制研究

目的探讨大肿瘤抑制因子2(LATS2)基因对缺氧复氧(H/R)诱导的H9C2心肌细胞凋亡及Wnt信号通路的影响。方法 LATS2 siRNA或LATS2过表达质粒转染H9C2心肌细胞,并分别转染阴性对照siRNA及空载体(vector),转染48 h后,通过Western blotting检测转染后的各组细胞中LATS2的蛋白表达;建立H/R模型,细胞分为正常对照组(Control组)、单纯缺氧复氧组(H/R组)、H/R+LATS2-siRNA组和H/R+pcDNA3.1-LATS2组,流式细胞术检测各组细胞凋亡率及活性氧(ROS)含量;Western blotting检测凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)及Wnt信号通路β-连环蛋白(β-catenin)和c-myc的蛋白表达。结果 siRNA组和PcDNA3.1组的LATS2蛋白表达与Control组差异无统计学意义(P>0.05),而LATS2-siRNA组LATS2的蛋白表达显著低于Control组(P<0.05),pcDNA3.1-LATS2组LATS2的蛋白表达显著高于Control组(P<0.05);与Control组比较,H/R组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著升高(P<0.05),与H/R组比较,H/R+LATS2-siRNA组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著升高,H/R+pcDNA3.1-LATS2组细胞凋亡率、ROS含量及cleaved caspase3、β-catenin和c-myc的蛋白表达均显著降低(P<0.05)。结论抑制LATS2基因表达可诱导心肌细胞凋亡及上调Wnt信号通路,而抑制LATS2基因表达反之。

人小细胞肺癌NCI-H446细胞成瘤组织中HSG及WNT/Ca^(2+)信号通路相关基因表达

目的探究细胞增殖抑制基因(HSG)、WNT5A、WNT11对人小细胞肺癌NCI-H446细胞成瘤的影响并探讨其作用机制。方法采用裸鼠成瘤技术在裸鼠皮下培养NCI-H446细胞肿瘤组织,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应检测成瘤组织与癌旁组织中HSG、WNT5A、WNT11基因的相对表达量。结果 20只接种NCIH446细胞悬液的裸鼠中,1只裸鼠于操作过程中死亡,15只裸鼠成功成瘤,成瘤率为78.9%。肿瘤组织中WNT5A、WNT11基因的相对表达量明显高于癌旁组织(P﹤0.01);肿瘤组织中HSG基因的相对表达量明显低于癌旁组织(P﹤0.01)。结论 HSG基因可能具有抑制小细胞肺癌成瘤的作用,WNT/Ca2+信号通路在NCI-H446细胞成瘤组织中大量开放并可能参与其成瘤过程。

sFRP-2抑制皮肤恶性黑色素瘤增殖的影响

目的探讨sFRP-2在皮肤恶性黑色素瘤细胞系和组织中表达,及对皮肤恶性黑色素瘤细胞A375增殖的影响,并初步探讨其作用机制。方法通过qRT-PCR和免疫组化实验分析sFRP-2在皮肤恶性黑色素瘤细胞系和组织中的表达;以及sFRP-2在皮肤恶性黑色素瘤中的临床病理特征。对表达沉默sFRP-2基因的A375细胞系分别感染慢病毒载体pLVX-Gfp-sFRP-2(实验组)和pLVX-Gfp-NC(对照组);免疫蛋白印迹实验验证sFRP-2的过表达;细胞增殖实验和克隆形成实验分析sFRP-2基因对细胞增殖的影响,流式细胞术分析对细胞增殖影响的分子机制;免疫蛋白印迹实验验证sFRP-2对WNT/β-catenin信号通路的影响。结果与正常色素痣相比,sFRP-2 mRNA和蛋白在皮肤恶性黑色素瘤细胞和组织中的中表达下调(P<0.001);过表达sFRP-2后细胞活性和增殖能力明显受到抑制(P<0.001);流式细胞实验发现:与对照组相比,过表达sFRP-2的实验组细胞阻滞于G1期(P<0.001),细胞凋亡率明显升高(P<0.001);过表达sFRP-2后WNT/β-catenin信号通路及其下游细胞因子明显受到抑制。结论 sFRP-2在人皮肤恶性黑色素瘤组织中表达下调,通过拮抗Wnt/β-catenin信号通路参与皮肤恶性黑色素瘤的进展。

2型人类表皮生长因子受体基因对结直肠癌自然杀伤细胞92局部浸润的影响及机制

目的探讨抑制2型人类表皮生长因子受体(HER2)基因表达对结直肠癌自然杀伤细胞92(NK92)细胞局部浸润的影响及机制。方法本研究起止时间为2018年5—11月。结直肠癌细胞(SW480、SW620和HT29)细胞及人正常肠上皮细胞(NCM460)购自美国模式培养物保藏所。Western blotting检测上述细胞中HER2的蛋白表达。Western blotting及ELISE检测HER2的特异性小干扰RNA(si-HER2)转染HT29细胞效率。Transwell小室检测重组HER2及肿瘤培养上清对NK92细胞迁移指数的影响。Transwell小室检测及Western blotting检测si-HER2对NK92细胞迁移指数及β-catenin表达影响。结果3株结直肠癌细胞HER2表达均明显高于在NCM460细胞表达[(0.104±0.011)、(0.141±0.015)、(0.243±0.018)比(0.018±0.003)]。对照组HER2蛋白及HER2含量均明显高于si-HER2组[(0.467±0.046)比(0.101±0.012),(125.3±10.1)pg/mL比(74.7±4.6)pg/mL]。重组HER2均能抑制NK92的迁移,促进β-catenin蛋白表达,而转染si-HER2可提高NK92迁移,且抑制β-catenin蛋白表达。结论抑制HER2基因表达可增强结直肠癌NK92细胞局部浸润,机制与下调Wnt/β-catenin信号有关。

人源R-spondin 2蛋白的生物信息学分析、表达、纯化及活性检测

目的构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性。方法基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu。将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白。最后,通过M50Super 8×TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性。结果生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95%的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC50值为1.5×10^(-12)mol/L。结论对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考。

多形性腺瘤基因样因子2在胃癌组织中的表达及其影响胃癌细胞侵袭、上皮-间充质转化的机制

目的观察多形性腺瘤基因样因子2(PLAGL2)在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达,探讨其对胃癌细胞侵袭、上皮-间充质转化(EMT)的影响及分子机制。方法采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和Western blot方法检测PLAGL2 mRNA和蛋白在胃癌及相应癌旁组织和人胃癌MKN-28、BGC-823、NCI-N87、SGC-7901细胞株中的表达。将PLAGL2小干扰RNA(siRNA)转染SGC-7901细胞,Real-time PCR、Western blot检测PLAGL2 mRNA和蛋白表达,Transwell侵袭实验检测敲低PLAGL2对细胞侵袭的影响,Western blot检测敲低PLAGL2对EMT相关分子标志物N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)及Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路相关分子表达的影响。分别采用Wnt/β-catenin信号通路激活剂SKL2001和抑制剂XAV939处理转染PLAGL2-siRNA的SGC-7901细胞,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭变化。结果PLAGL2 mRNA和蛋白在胃癌组织中的表达量(mRNA:1.11±0.27;蛋白:0.98±0.26)高于癌旁组织(mRNA:0.37±0.10;蛋白:0.28±0.11;t=-20.941,P<0.01;t=-20.186,P<0.01)。PLAGL2 mRNA和蛋白在胃癌细胞株MKN-28、BGC-823、NCI-N87、SGC-7901中的表达量高于人胃黏膜正常细胞GES-1(mRNA:t=-12.327,P<0.01;t=-19.812,P<0.01;t=-13.080,P<0.01;t=-15.218,P<0.01;蛋白:t=-11.816,P<0.01;t=-21.162,P<0.01;t=-14.517,P<0.01;t=-15.899,P<0.01)。转染后,SGC-7901的PLAGL2 mRNA和蛋白表达(mRNA:2.10±0.29;蛋白:1.96±0.27)较Control siRNA组(mRNA:6.61±0.73;蛋白:6.46±0.71)显著降低(t=-1.000,P<0.01;t=-1.000,P<0.01)。转染24、48、72 h后PLAGL2-siRNA组侵袭细胞数[(30.75±5.74)、(48.75±6.90)、(64.50±4.80)个]较Control siRNA组[(51.00±4.97)、(75.75±4.92)、(132.50±5.57)个]显著减少(t=-1.000,P<0.05;t=-1.000,P<0.01;t=-1.000,P<0.01),同时N-cadherin、Vimentin、β-catenin、基质金属蛋白酶(MMP)-7、c-Myc蛋白表达显著降低,E-cadherin蛋白表达显著增高(t=-1.000,P<0.01;t=-1.000,P<0.01;t=-1.000,P<0.01;t=-1.000,P<0.01;t=-1.000,P<0.01;t=-8.205,P<0.01)。此外,SKL2001能够逆转敲低PLAGL2对SGC-7901细胞侵袭的抑制作用,XAV939则能够进一步加强以上作用。结论胃癌组织PLAGL2表达上调,siRNA干扰PLAGL2可通过抑制Wnt/β-cateninn信号通路的激活和EMT抑制胃癌侵袭。

sFRP-2抑制皮肤恶性黑色素瘤增殖的实验研究

目的观察sFRP-2在皮肤恶性黑色素瘤细胞系和组织中的表达及对皮肤恶性黑色素瘤细胞A375增殖的影响,并探讨其作用机制。方法通过qRT-PCR和免疫组化实验,分析sFRP-2在皮肤恶性黑色素瘤细胞系和组织中的表达及在皮肤恶性黑色素瘤中的临床病理特征。选取sFRP-2基因表达最低的A375细胞作为实验研究对象;分别感染慢病毒载体p LVX-Gfp-sFRP-2(实验组)和pLVX-Gfp-NC(对照组);免疫蛋白印迹实验验证sFRP-2的过表达;细胞增殖实验和克隆形成实验分析sFRP-2基因对细胞增殖的影响;免疫蛋白印迹实验验证sFRP-2对WNT/β-catenin信号通路的影响。结果与正常色素痣相比,sFRP-2 m RNA和蛋白在皮肤恶性黑色素瘤细胞和组织中的表达下调(P<0.001);过表达sFRP-2后,细胞活性和增殖能力明显受到抑制(P<0.001),而且WNT/β-catenin信号通路及其下游细胞因子明显受到抑制。结论sFRP-2在人皮肤恶性黑色素瘤组织中表达下调,通过拮抗Wnt/β-catenin信号通路参与皮肤恶性黑色素瘤的进展。

WISP2基因rs2281862位点C>T多态性与胃癌预后的关系

目的探讨中国江苏省宜兴地区汉族人群中Wnt-1诱导分泌蛋白2(WISP2)基因rs2281862位点C>T多态性与胃癌预后的关系。方法应用TaqMan探针的RT-PCR法检测952例胃癌患者的基因型,分析不同基因型与胃癌预后的关系。结果与WISP2基因rs2281862位点CC基因型相比,合并突变基因型TC和TT与胃癌的预后无显著相关性(P>0.05)。Lauren分型与胃癌患者的预后相关:与合并基因型CC和TC相比,在肠型胃癌患者中,TT型患者的预后危险性下降(P<0.05),而在弥漫型胃癌患者中,TT型患者的预后危险性增加(P<0.05)。结论中国江苏省宜兴地区汉族人群WISP2基因rs2281862位点与胃癌预后无关;TT基因型是肠型胃癌患者的保护性因素,但也是弥漫型胃癌患者的危险性因素。

靶向抑制人滋养层细胞表面抗原-2基因表达诱导宫颈癌细胞凋亡的机制研究

目的探讨抑制人滋养层细胞表面抗原-2(TROP2)基因表达对宫颈癌细胞凋亡的影响。方法空白对照组(Control组)、阴性对照无意义小干扰RNA siRNA序列组(Control siRNA组)和转染TROP2的靶向siRNA序列组(TROP2 siRNA组)转染人宫颈癌Hela细胞,48 h后蛋白印迹检测TROP2、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase3)、β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期素D1(Cyclin D1)蛋白表达;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果转染TROP2-siRNA后能显著降低TROP2的蛋白表达;TROP2-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3蛋白表达显著高于Control组,β-catenin、Cyclin D1蛋白表达显著低于Control组(P<0.01),Control-siRNA组细胞凋亡率及Cleaved caspase3、β-catenin、Cyclin D1蛋白表达与Control组差异无统计学意义(P>0.05)。结论抑制宫颈癌细胞中TROP2基因表达可促进癌细胞的凋亡,其机制与上调Cleaved caspase3蛋白表达及下调Wnt/β-catenin信号通路有关。

BAG-1基因的小干扰RNA转染对肝癌细胞生物学特性的影响

目的观察RNA干扰BAG-1基因表达对肝癌细胞增殖凋亡及Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路的影响。 方法以人正常肝癌细胞L02作为对照细胞，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot分别检测BAG-1在无转移能力的HepG2、Huh7人肝癌细胞株及转染潜能依次增高的MHCC97L、MHCC97H、HCCLM3人肝癌细胞株中的表达；将阴性小干扰RNA（siRNA）和BAG-1-siRNA转染HCCLM3细胞，不转染的细胞为空白对照组，转染48 h后检测转染效果；分别于转染后的24、48、72 h通过细胞计数试剂盒（CCK-8）实验检测细胞的增殖；流式细胞仪检测转染48 h细胞的凋亡；Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、生存素（Survivin）、c-Myc的蛋白表达。 结果BAG-1在肝癌细胞中的表达均显著高于对照细胞L02（mRNA表达：PHepG2＝0.000；PHuh7＝0.000；PMHCC97L＝0.000；PMHCC97H＝0.000；PHCCLM3＝0.000；蛋白表达：PHepG2＝0.030；PHuh7＝0.001；PMHCC97L＝0.000；PMHCC97H＝0.000；PHCCLM3＝0.000）；BAG-1-siRNA转染HCCLM3细胞后BAG-1的蛋白表达（0.097±0.010）显著低于空白对照组（0.489±0.039）（P＝0.000）；BAG-1-siRNA转染HCCLM3细胞48 h（0.312±0.024）和72 h（0.398±0.036）后细胞的增殖显著低于空白对照组（0.448±0.032）、（0.673±0.051）（P48 h＝0.004；P72 h＝0.002）；与空白对照组（2.13±0.11）%、（0.512±0.048）、（0.349±0.032）、（0.166±0.015）比较，BAG-1-siRNA组细胞凋亡率[（13.47±1.05）%]显著升高，β-catenin（0.247±0.028）、Survivin（0.153±0.017）、c-Myc（0.089±0.009）蛋白显著下调表达（Pβ-catenin＝0.001；PSurvivin＝0.001；Pc-Myc＝0.002）。 结论抑制BAG-1表达可通过下调Wnt/β-catenin信号通路降低肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡。