以具有WPRE调控元件的杆状病毒为载体在鸡胚原代细胞中表达新城疫病毒F基因

【目的】构建具有哺乳动物细胞特异性启动子和基因转录后调控元件的重组杆状病毒转移载体,优化的重组杆状病毒可介导新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因在鸡原代骨骼肌细胞中进行高效表达。【方法】提取NDV La Sota株病毒RNA基因组,用RT-PCR技术扩增F基因,将其克隆到自主构建的具有转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element,WPRE)的杆状病毒转移载体的CMV启动子下游,通过Bac-to-Bac系统获得F重组Bacmid,经转染Sf9昆虫细胞后获得F重组杆状病毒。重组病毒经扩增后以50个MOI感染鸡原代骨骼肌细胞,接种72 h后裂解细胞收获蛋白。比较分析WPRE调控元件对蛋白表达水平的影响。【结果】经Western blot证实在鸡原代骨骼肌细胞中表达了NDV F蛋白,分子量约56 kDa,与预测蛋白大小一致,且能被NDV阳性血清所识别。添加WPRE转录后调控元件的重组杆状病毒介导F蛋白的表达效果与添加10 mmol/L丁酸盐法基本相同,但对细胞几乎没有毒性。【结论】优化后的重组杆状病毒可以向鸡原代细胞中传递NDV F基因,并在CMV的启动下表达具有反应原性的F蛋白,添加的转录后调控元件WPRE可以增强杆状病毒介导外源基因在鸡原代细胞中的表达水平。本研究为研制NDV及其他重要禽类传染病的杆状病毒载体基因工程疫苗奠定了基础。

淋巴瘤特异性高效基因表达载体survivin-VISA的构建与鉴定

目的构建含survivin启动子及VP16-GAL4-WPRE整合型系统性放大系统(VISA)的淋巴瘤特异性高效基因表达载体survivin-VISA(S-VISA)。方法应用基因重组技术构建含survivin启动子与土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、二步转录放大系统(TSTA)和VISA系统分别构成的表达载体S-WPRE、S-TSTA和S-VISA,经PCR法及酶切鉴定。用脂质体法转染淋巴瘤细胞株Ramos、U937、Raji及人肝细胞株Chang Liver,检测荧光素酶活性。结果表达载体S-WPRE、S-TSTA和S-VISA通过PCR法及酶切鉴定证明构建正确,荧光素酶活性检测表明S-VISA载体在淋巴瘤细胞中实现了目的基因特异性高效表达。结论成功构建了含survivin启动子及VISA系统的淋巴瘤特异性高效基因表达载体S-VISA,为淋巴瘤基因治疗的进一步研究奠定了良好的基础。