慢病毒介导的犬WRD细胞p53基因沉默及稳定感染细胞系的建立

目的构建靶向犬p53基因慢病毒干扰载体,建立稳定沉默p53基因的WRD/p53-细胞系。方法设计并构建4条针对犬p53基因的特异性shRNA干扰质粒。将构建的慢病毒表达载体(p GMLV-p53)和包装质粒(packaging mix)组成的包装系统共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。包装好的慢病毒感染WRD细胞,Western blot和实时荧光定量PCR方法检测不同靶点RNA干扰载体对p53基因的干扰效果,确定有效靶点。针对有效靶点慢病毒颗粒以最适感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染WRD细胞,puromycin抗生素筛选稳定感染细胞系WRD/p53-。结果结果显示p53 RNAi慢病毒载体构建成功,成功包装四种不同靶点的p53基因RNA干扰慢病毒,病毒滴度均达到1×109TU/ml。四种干扰载体慢病毒均具有较好的干扰效果,选用沉默效果最好的p GMLV-p53A1为最优靶点,成功建立p53 RNAi慢病毒载体稳定感染细胞系WRD/p53-。结论成功构建p53 RNAi慢病毒载体,并有效干扰WRD细胞中p53 mRNA和蛋白表达,同时成功筛选并建立p53RNAi慢病毒稳定感染WRD/p53-细胞系。

犬转铁蛋白受体基因的沉默及稳定感染细胞系的建立

目的通过构建沉默犬转铁蛋白受体(TfR)基因慢病毒载体并感染Walter Reed犬(WRD)细胞,建立稳定感染沉默犬TfR基因的细胞系。方法构建2条针对犬TfR基因的特异性短发夹RNA(shRNA),用慢病毒载体转染HEK293T细胞,包装、收集病毒并测定其滴度。用包装好的慢病毒感染WRD细胞,用实时荧光定量PCR和Western blot法检测TfR的mRNA和蛋白的表达水平以评价干扰效率,筛选沉默效果较好的靶点,并建立稳定沉默TfR基因的WRD/TfR-细胞系。结果成功构建出TfR小干涉RNA慢病毒载体,成功包装2种不同靶点的沉默TfR基因的RNA干扰慢病毒,测定其病毒滴度均达到1×108转导单位(TU)/m L。选用沉默效果较好的p GMLV-TfR A2载体,建立TfR小干涉RNA慢病毒载体稳定感染的WRD/TfR-细胞系。结论成功构建TfR小干涉RNA慢病毒载体并建立了稳定感染WRD/TfR-细胞系。

p53抑制剂PFT-α对犬博卡病毒感染致靶细胞病变的影响

目的探讨p53抑制剂(pifithrin alpha,PFT-α)对犬博卡病毒(minute virus of Canine,MVC)感染致WRD细胞(walter reed canine,WRD)病变的影响。方法首先MVC感染WRD细胞72h后,DAPI染色并观察靶细胞的形态学变化;给予不同浓度梯度的PFT-α处理WRD细胞,MTS法检测PFT-α对WRD细胞的毒性作用,以确定PFT-α的安全使用剂量;利用安全剂量的PFT-α分别采取提前(MVC感染前1h)或同时与病毒感染靶细胞,MTS试剂法检测PFT-α加入的不同方式对博卡病毒MVC感染致靶细胞病变的影响;以不同MVC感染复数(multiplicity of infection,MOI)处理WRD细胞,观察PFT-α在安全剂量和最佳处理方式作用下对MVC感染致靶细胞WRD病变的影响。结果 MVC感染致WRD细胞发生明显的凋亡等病理性改变;20μmol·L-1的PFT-α浓度是WRD细胞的安全使用剂量;安全剂量的PFT-α加入能够明显提高受感染细胞的细胞活力,与对应感染组相比差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论 PFT-α能够降低犬博卡病毒感染致WRD细胞病变的程度。