茎用莴苣2个WRKYⅢ亚族转录因子基因的克隆与表达

为了揭示WRKYⅢ亚族转录因子基因在茎用莴苣不同生物学过程中的作用,该研究在茎用莴苣品种‘永安红’中克隆得到了2个WRKYⅢ亚族转录因子基因LsWRKY 08和LsWRKY 37,并对其进行了序列比对、进化树构建、qRT-PCR分析、互作网络及启动子分析,为深入研究茎用莴苣WRKYⅢ亚族转录因子的功能、提高茎用莴苣的产量和品质奠定理论基础。结果表明:(1)LsWRKY08和LsWRKY37转录因子分别含有945和930 bp的开放阅读框,分别编码314和309个氨基酸。(2)qRT-PCR分析表明,LsWRKY 08基因在叶片中的表达量比在根和茎中的表达量高,其中在茎膨大过程中,其表达量逐渐降低,而在干旱、高温、低温、盐等非生物胁迫中的表达量均比对照提高,且LsWRKY 08基因在SA处理中表达量较对照明显增加;LsWRKY 37基因在根中的表达量比在叶和茎中高,其在茎膨大过程中的表达模式与LsWRKY 08基因不同,LsWRKY 37基因在不同非生物胁迫下的表达模式存在差异。(3)互作网络分析发现,LsWRKY08和LsWRKY37可与植物防御相关蛋白以及其他转录因子存在互作;启动子鉴定发现,LsWRKY 08和LsWRKY 37基因启动子区存在多个顺式作用元件,其中LsWRKY 37启动子含有W-box元件,表明LsWRKY 37可能与其他WRKY转录因子之间存在自我调节和交叉调节。研究认为,LsWRKY 08和LsWRKY 37基因能响应不同非生物胁迫以及激素处理,但2个基因之间表达模式存在差异,推测同一亚族的转录因子基因功能可能存在差异,且LsWRKY08和LsWRKY37转录因子可通过与其他蛋白相互作用或受其他基因调控来参与不同的生物学过程。

小麦ERF亚族转录因子参与逆境胁迫的研究进展

小麦是中国三大粮食作物之一,其生长发育过程中会受到多种逆境胁迫的影响。AP2/EREBP是植物特有的一个庞大的转录因子超家族,普遍参与生长发育和逆境胁迫应答等生物学进程。ERF类转录因子是AP2/EREBP转录因子超家族的一个亚族。本研究结合国内外相关研究进展,简要综述了小麦ERF亚族转录因子的结构特征与分布,重点阐述近年来小麦ERF亚族转录因子响应高盐、干旱、低温、重金属、病原菌侵染等逆境胁迫的功能和机制研究进展,最后展望了ERF亚族转录因子的研究方向和应用前景。

小麦WRKY转录因子TaWRKY72B的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY蛋白是一类转录因子,参与调控植物的多种生长发育和胁迫应答过程。为进一步探究WRKY在小麦响应逆境中的作用,本研究克隆了小麦中国春的TaWRKY72B基因,并对其进行了生物信息学、亚细胞定位和表达模式分析。结果表明,中国春的TaWRKY72B基因编码320个氨基酸,蛋白序列包含典型的WRKY保守结构域和C2H2锌指结构,分子量为33.94 kDa,理论等电点为6.60,是酸性亲水的不稳定蛋白,无信号肽序列,属非跨膜蛋白。二级结构预测表明,TaWRKY72B主要由无规则卷曲(61.25%)、α-螺旋(23.12%)、延伸链(11.88%)和β-转角(3.75%)组成。TaWRKY72B定位于细胞核,符合转录因子特征。系统进化树分析显示,TaWRKY72B蛋白与节节麦、大麦和水稻等禾本科作物的WRKY亲缘关系较近。启动子顺式作用元件预测结果表明,该基因含有多个与生长发育、激素信号途径以及非生物胁迫应答相关的顺式调控元件。TaWRKY72B表达受激素、高温、低温和盐诱导,推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答和多种激素信号途径。

紫花苜蓿WRKY转录因子基因的克隆与亚细胞定位

WRKY转录因子家族在植物生长发育各个阶段发挥重要作用。本研究运用电子克隆和RT-PCR结合的方法获得1个紫花苜蓿WRKY转录因子家族成员的cDNA序列,命名为MsWRKY56。该序列长1 267bp,包含1个951bp的最大开放阅读框,编码317个氨基酸;构建该基因的瞬时表达载体,通过基因枪轰击洋葱表皮的方法对编码蛋白进行亚细胞定位研究,结果表明该基因编码蛋白定位于细胞核,符合转录因子的亚细胞定位特征,为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。

沪油15中两个AP2/ERF-B1亚族转录因子的克隆与分析

利用油菜EST数据库,以拟南芥ERF-B1亚族转录因子序列为探针,电子克隆拼接得到2个cDNA序列(BnaERFB1-1和BnaERFB1-2),通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜沪油15的DNA和cDNA中克隆了上述基因。克隆转录因子BnaERFB1-1-Hy15和BnaERFB1-2-Hy15与电子克隆的序列差异很小,分别只有2个和6个氨基酸位点不同,且都没有内含子。从cDNA序列、氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、进化树、序列比对、功能域、二级和三级结构等方面进行了分析,结果显示,BnaERFB1-1-Hy15和BnaERFB1-2-Hy15转录因子属于AP2/ERF家族中的ERF-B1亚族,是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与拟南芥atERF7相似。EST丰度分析显示,BnaERFB1-1的表达主要集中在种子中,而BnaERFB1-2的表达则主要集中在分生组织中。

玉米A亚族bZIP转录因子基因ZmbZIP81的克隆、表达与功能分析

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)蛋白是真核生物所特有的一类转录因子,对于植物在逆境下的基因表达调控具有重要作用。为丰富对玉米bZIP转录因子功能的认识,本研究以从玉米中克隆到的一个A亚族bZIP转录因子编码基因ZmbZIP81为对象展开。ZmbZIP81基因位于玉米第6染色体,编码区全长2492 bp,由4个外显子和3个内含子组成,编码蛋白含254个氨基酸。研究表明ZmbZIP81基因表达受外源ABA、NaCl和干旱胁迫诱导。过表达该基因的拟南芥植物表现出ABA不敏感和NaCl胁迫抗性增强的表型,推测ZmbZIP81可能作为ABA信号途径的负调控因子参与植物抗逆基因表达调控网络。

油菜沪油15中AP2/ERF-B3亚族转录因子的克隆和生物信息学分析

AP2/ERF转录因子家族广泛存在于植物中,参与植物细胞周期、生长发育以及生物和非生物胁迫相关基因表达调控。本文利用油菜UniGene数据库,以拟南芥AP2/ERF-B3亚族转录因子保守序列为信息探针,分离得到2个油菜AP2/ERF-B3亚族的转录因子BnaERFB3-1和BnaERFB3-2。通过PCR和RT-PCR方法分别从双低甘蓝型油菜沪油15的DNA和cDNA中克隆了上述基因。序列分析显示,克隆的BnaERFB3-1-Hy15和BnaERFB3-2-Hy15转录因子与电子克隆的基因序列差异很小,均只有1个氨基酸位点不同,且都没有内含子。从氨基酸序列的相似性、组成成分、理化性质、疏水性/亲水性、序列比对、进化树、功能域、二级结构、三级结构、无序化特性等方面进行了预测和较为全面的分析。结果显示BnaERFB3-1-Hy15和BnaERFB3-2-Hy15是亲水性蛋白,在蛋白质的三级结构上与AtERF5相似,BnaERFB3-1-Hy15和BnaERFB3-2-Hy15蛋白无序化程度大于拟南芥AtERF5。通过分析EST丰度显示,BnaERFB3-1的表达集中在种子中,而BnaERFB3-2的表达则集中在根中。另外,将上述基因分别构建入酵母表达载体和植物双元表达载体,为深入研究该基因在油菜抗逆调控中的作用奠定了基础。

玉米D亚族bZIP转录因子基因的数据库挖掘、分析、克隆与表达

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)是真核生物特有的转录因子家族,在高等植物基因表达与调控中起重要作用。本文通过对玉米基因组数据库中收录的全长cDNA序列全基因组范围的bZIP分析,发现其中25个序列编码D亚族bZIP转录因子。针对这些序列进行生物信息学分析、染色体分布和直系同源组的分类分析,发现部分序列可能是由同一基因座编码,但不同方式剪切形成的。对部分基因克隆和测序发现了更多的剪切形式。定量检测其中3个基因在ABA和干旱胁迫条件下的表达发现,其中1个受ABA诱导,2个受ABA抑制,但均不受干旱胁迫影响。表明玉米中D亚族基因可能参与ABA响应。

谷子WRKY36转录因子的分子特性及功能鉴定

【目的】干旱等非生物胁迫严重影响了植物的生长和作物的产量。WRKY转录因子广泛参与了植物生长发育、形态建成和代谢调控等过程,在调控非生物胁迫响应中也扮演着十分重要的角色。分析谷子Si WRKY36的分子特性和功能,解析谷子转录因子的抗逆调控机制。【方法】通过对干旱胁迫谷子转录组测序结果分析,获得了一个WRKY转录因子Si WRKY36;利用生物信息学的方法分析谷子Si WRKY36的分子特性;根据Si WRKY36蛋白序列进行同源性搜索,得到与谷子Si WRKY36蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5对谷子Si WRKY36蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEME和SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用GSDS和PHYRE2在线工具分别对谷子Si WRKY36基因结构和三级结构进行分析;从谷子基因组数据库Phytozome获取谷子Si WRKY36上游2 000 bp作为启动子;用PLACE数据库对Si WRKY36启动子顺式作用元件进行分析;利用实时荧光定量PCR检测Si WRKY36在不同胁迫条件下(PEG、低温、Na Cl、Me JA、ABA、GA和SA、H2O2)的表达模式;分别以8种胁迫处理的谷子c DNA作为模板,以谷子Si001873m.g为内参,以SYBR Green染料法进行real-time PCR。用实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增;将Si WRKY36的c DNA序列连入带有Ca MV 35S启动子的p BI121表达载体中,构建表达载体p BI121-Si WRKY36,转入农杆菌,侵染野生型拟南芥得到转基因株系。用T3转Si WRKY36拟南芥植株进行抗性鉴定。【结果】谷子Si WRKY36全长1 485 bp,基因编码区包含UTR区和3个内含子以及4个外显子,与柳枝稷亲缘性最高,属于WRKY转录因子家族的第一类。Si WRKY36编码蛋白包含2个WRKY保守域,预测的Si WRKY36蛋白三级结构包含2个α螺旋结构和3个β折叠结构。启动子元件分析表明Si WRKY36包含ABA-responsive element(ABRE)、MYB、MYC、low-temperature-responsive element(LTRE)、GT-1等多种逆境胁迫应答元件。实时荧光定量PCR结果显示Si WRKY36对多种非生物胁迫和激素均有不同程度的响应,但在H2O2和低温处理下基因表达量无明显变化;亚细胞定位结果表明Si WRKY36蛋白主要定位于细胞核中。抗性鉴定结果显示,在不进行任何处理的MS培养基上,野生型拟南芥和过表达株系拟南芥的长势基本一致;在2%PEG的处理条件下,3个转基因株系的根长、根的总表面积和根的总体积要大于野生型拟南芥。【结论】Si WRKY36转基因植株可能对轻度干旱有一定的抗性。

荔枝LcWRKY47基因的克隆、亚细胞定位、表达及延缓果实褐变的功能初探

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是亚热带地区重要的经济作物之一,但荔枝采后难贮存、易褐变,是目前保鲜过程中存在的最大问题之一。WRKY家族是植物中常见的一类转录因子,主要调控植物的逆境胁迫响应以及成熟衰老等生理过程。为了探究WRKY对采后荔枝果实成熟衰老的影响,本研究以妃子笑荔枝为试验对象,克隆LcWRKY47基因,长度为1077 bp;LcWRKY47编码的蛋白中含有WRKY保守结构域,二级结构以无规则卷曲为主,占比65.64%,三级结构主要为无规则卷曲和α-螺旋。通过motif分析及多序列比对,发现LcWRKY47蛋白属于第Ⅱ类WRKY转录因子;系统进化分析树表明荔枝LcWRKY47与同为无患子科的龙眼DlWRKY47亲缘关系最近;亚细胞定位试验表明,LcWRKY47蛋白定位在细胞核中;RT-qPCR分析表明,2mmol/L草酸处理后LcWRKY47基因在荔枝果皮和果肉中的表达趋势相同,均先升后降,后期处理组表达量均显著高于对照组,推测草酸处理后该转录因子在荔枝果实成熟衰老过程中起正调控作用。过表达LcWRKY47基因发现,转基因果实中LcWRKY47的表达量显著高于对照果实,且转基因荔枝衰老褐变情况明显优于处理组。综上推测,LcWRKY47转录因子可能在荔枝衰老与褐变过程中起着调节作用。

水稻中两个同源异型结构域转录因子的亚细胞定位

为了对水稻同源异型结构域转录因子HD-ZipⅢ家族中的HDZ1和HDZ2进行亚细胞定位,利用RT-PCR技术从水稻cDNA中扩增HDZ1和HDZ2的编码区(去除终止密码子序列),与绿色荧光蛋白GFP编码框融合,构建2个转录因子的瞬时表达载体,采用农杆菌介导的转化方法转化至烟草中进行瞬时表达分析.结果表明:PCR扩增所得为目的基因片段HDZ1和HDZ2;二者与载体质粒pCAMBIA35S-GFP连接获得的融合表达载体成功移至烟草中并表达;确定HDZ1主要定位于烟草叶片的气孔中,而HDZ2定位于烟草表皮细胞的细胞膜上.二者在亚细胞中的定位不同,可能在水稻生长发育中所起的作用也不相同.

油菜AP2/ERF-B4类转录因子克隆及表达载体的构建

利用油菜UniGene数据库,以拟南芥转录因子保守序列为探针,通过电子克隆方法分离得到一个UniGene库Bna.17538,进一步序列拼接得到一个油菜AP2/ERF-B4亚族的转录因子BnaERFB4-1,长度为672 bp,并进行了相关的生物信息学分析.结果显示BnaERFB4-1是亲水性蛋白,蛋白质三级结构与拟南芥RAP2.6L非常相似,蛋白质无序化程度大于拟南芥RAP2.6L.设计引物通过PCR和RT-PCR方法分别从甘蓝型油菜沪油15幼苗的DNA和cDNA中分离了BnaERFB4-1基因,命名为BnaERFB4-1-Hy15.序列测定和分析显示,来源于沪油15的BnaERFB4-1-Hy15基因与电子克隆的基因序列差异很小,有3个氨基酸位点不同,存在一个内含子.将BnaERFB4-1-Hy15基因通过BamHⅠ和SacⅠ酶切后分别插入酵母表达载体YK3302和植物双元表达载体pYF1404的相应位置,构建了BnaERFB4-1-Hy15基因的酵母体内结合和植物转化载体,为深入研究该基因在油菜抗逆调控中的作用奠定了基础.

转录因子FoxO1与miR-142-3p在口腔鳞癌中的表达关系及意义

目的探讨转录因子叉头框转录因子O亚族1(FoxO1)与微小RNA-142-3p(miR-142-3p)在口腔鳞癌(OSCC)中的表达关系及意义。方法选取2016年5月~2018年6月于本院手术中留取的OSCC组织72份为观察组,选取50份形态学正常的癌旁口腔黏膜组织为对照组,比较两组FoxO1、miR-142-3p表达与OSCC临床病理特征的关系及二者的相关性,并采用COX回归模型分析OSCC患者预后不良事件的影响因素。结果观察组较对照组FoxO1阳性表达率、miR-142-3p表达均较低(P<0.05);高分化、中分化、低分化相比,FoxO1阳性表达率、miR-142-3p表达均依次降低(P<0.05);与Ⅰ~Ⅱ期相比,Ⅲ~Ⅳ期FoxO1阳性表达率、miR-142-3p表达均较低(P<0.05);与无淋巴结转移相比,淋巴结转移者FoxO1阳性表达率、miR-142-3p表达均较低(P<0.05)。Spearman结果显示,观察组FoxO1、miR-142-3p表达呈正相关(P<0.05)。单因素分析显示,性别、年龄、BMI、病理分级均与OSCC患者不良预后无关(P>0.05),临床分期、淋巴结转移、FoxO1、miR-142-3p均是OSCC患者不良预后的影响因素(P<0.05)。多因素分析显示,临床分期、淋巴结转移、FoxO1、miR-142-3p均是影响OSCC患者预后发生不良事件的独立危险因素(P<0.05)。结论FoxO1、miR-142-3p与OSCC的发生、发展及预后密切相关,FoxO1可能受miR-142-3p的靶向调控,这一结果可为病情评估及治疗靶点提供临床参考依据。

拟南芥R2R3-MYB家族第22亚族的结构与功能

拟南芥R2R3-MYB转录因子在拟南芥生长发育、代谢及响应生物和非生物胁迫的调控网络中具有重要作用。根据保守的氨基酸序列,R2R3-MYB转录因子被分为25个亚族,其中第22亚族包含AtMYB44、AtMYB77、AtMYB73和AtMYB70 4个基因,主要响应生物和非生物胁迫。文章从基因功能的相似性、基因表达的一致性和基因结构的保守性3方面综述了第22亚族的4个基因,并综合讨论了其在结构与功能上的冗余性和多样性。

转录因子FOXO1和干细胞标志物CD133与神经母细胞瘤临床病理因素相关性

目的探究叉头框转录因子O亚族(FOXO)1与干细胞标志物CD133在神经母细胞瘤(NB)中的表达及其相关性分析。方法使用免疫组织化学方法检测53例NB组织(病例组)和27例癌旁正常组织(对照组)中FOXO1和CD133蛋白表达情况;应用Western印迹检测3例NB组织及3例癌旁组织FOXO1和CD133蛋白表达情况。结果FOXO1在病例组中阳性表达率显著低于对照组;CD133在病例组中阳性表达率显著高于对照组;FOXO1、CD133与临床分期、组织类型和病理分型存在相关性(P<0.05);FOXO1在NB组织显著低于癌旁组织,而CD133在NB组织显著高于癌旁组织;FOXO1和CD133在蛋白表达水平上有明显相关性(P<0.05)。结论FOXO1可能通过负性调节CD133表达来调节NB干细胞特性,是NB发生发展的重要机制。

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一,在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库,从新台糖22(ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因,命名为Sc WRKY4(Gen Bank登录号为MG852087)。序列分析发现,Sc WRKY4基因c DNA全长1265 bp,包含1个741 bp的完整开放读码框,编码246个氨基酸,该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C2H2锌指结构域,属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现,Sc WRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域,蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中,Sc WRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示,Sc WRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明,Sc WRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异,在蔗肉中的表达量最高,为对照蔗根的18.38倍;黑穗病菌侵染0~72 h,Sc WRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达,在感病品种ROC22中表达较稳定;受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后,Sc WRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明,Sc WRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用,但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。

胡萝卜AP2／ERF-B1亚族两个转录因子基因的克隆及其非生物胁迫响应分析

AP2/ERF是植物中普遍存在的一类重要转录因子,参与植物整个生命周期的生长发育和逆境信号转导。本研究以胡萝卜(Daucus carota)‘黑田五寸’为试验材料,基于其转录组和基因组数据,检索和拼接获得胡萝卜AP2/ERF家族2个转录因子基因序列g39811和g47170。采用RT-PCR方法,分别从‘黑田五寸’中克隆DcERF-B1-1(g39811)和DcERF-B1-2(g47170)转录因子基因。序列分析显示,胡萝卜DcERF-B1-1和DcERF-B1-2转录因子基因分别含有630个和594个开放阅读框,分别编码209和197个氨基酸;均含有相对保守的AP2结合域,具有典型的植物AP2/ERF类转录因子特征。从氨基酸组成成分、理化性质、亲水性/疏水性和三级结构上分析显示,胡萝卜DcERF-B1-1和DcERF-B1-2转录因子亲水性大于疏水性,其氨基酸序列可能属于亲水性蛋白。空间结构分析显示,它们都具有1个α螺旋和3个β折叠。进化树分析显示,二者均属于AP2/ERF家族转录因子中ERF亚族的B1组。实时定量荧光PCR显示,在低温、干旱、盐胁迫的条件下,DcERF-B1-2转录因子比DcERF-B1-1转录因子对逆境的响应更大;在高温的条件下,DcERF-B1-1转录因子比DcERF-B1-2转录因子对逆境的响应更大。

膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa单抗通过抑制HMGB1/TLR4途径减轻ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化(英文)

观察膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa单抗对小鼠动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)病变和HMGB1/TLR4途径基因表达变化的影响,以探讨膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂对As进程的影响及其机制.30只5周龄雄性ApoE-/-小鼠随机均分为3组:溶剂对照组(生理盐水50μl,腹腔注射),IgG对照组(50μg,腹腔注射),GPⅡb/Ⅲa单抗组(50μg,腹腔注射).实验ApoE-/-小鼠均已高脂、高胆固醇饲料喂养,10周后处死动物.油红O染色观察主动脉窦As病变;活体荧光显微镜观察颈总动脉As病变处血小板黏附;Western blot检测HMGB-1、TLR4与NF-κB蛋白的表达;免疫组化观察主动脉窦As病变部位MOMA-2和VCAM-1的表达;ELISA法检测血浆中HMGB-1、IL-1β、TNF-α与MCP-1的含量.研究结果表明:与对照组相比,GPⅡb/Ⅲa单抗组ApoE-/-小鼠As病变和血小板黏附显著减少(P<0.05);且该组小鼠主动脉TLR4与NF-κB蛋白的表达明显降低;其血清中的HMGB-1、IL-1β、TNF-α与MCP-1的水平也明显下降(P<0.05).此外,GPⅡb/Ⅲa单抗治疗显著减少As病变处MOMA-2和VCAM-1的表达(P<0.05).GPⅡb/Ⅲa单抗减轻ApoE-/-小鼠As病变可能与抑制HMGB1/TLR4途径介导的炎症有关.

氧化苦参碱调控FOXO1表达对TNF-α诱导HaCaT细胞炎症因子分泌的影响

目的探讨氧化苦参碱调控叉头框转录因子O亚族1(FOXO1)表达对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的HaCaT细胞炎症因子分泌的影响。方法细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测不同浓度TNF-α对HaCaT细胞增殖活性的影响,筛选TNF-α诱导浓度和时间。将诱导后的HaCaT细胞分为模型组(25μg/L TNF-α)、氧化苦参碱组(25μg/L TNF-α和40 mg/mL氧化苦参碱,未转染)、氧化苦参碱+LV-NC-GFP组(25μg/L TNF-α和40 mg/mL氧化苦参碱,转染空载体)、氧化苦参碱+LV-CA-FOXO1组(25μg/L TNF-α和40 mg/mL氧化苦参碱,转染FOXO1过表达载体),另取正常培养的HaCaT细胞为对照组。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测细胞中FOXO1表达水平;CCK-8法检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA法检测细胞中炎性因子:肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)含量;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测细胞中AKT、TLR-4和FOXO1蛋白表达水平。结果本研究采用25μg/L TNF-α处理24 h诱导HaCaT细胞。与对照组相比,模型组HaCaT细胞FOXO1 mRNA表达水平、细胞增殖活性、TNF-α、IL-6、IL-1β含量以及TLR-4、FOXO1蛋白表达和AKT磷酸化水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。与模型组相比,氧化苦参碱组和氧化苦参碱+LV-NC-GFP组HaCaT细胞FOXO1 mRNA表达水平、TNF-α、IL-6、IL-1β含量以及TLR-4、FOXO1蛋白表达和AKT磷酸化水平显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。与氧化苦参碱+LV-NC-GFP组相比,氧化苦参碱+LV-CA-FOXO1组HaCaT细胞FOXO1 mRNA表达水平、细胞增殖活性、TNF-α、IL-6、IL-1β含量以及TLR-4、FOXO1蛋白表达和AKT磷酸化水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结论氧化苦参碱可能通过靶向抑制FOXO1表达降低炎性因子分泌,并可促进HaCaT细胞凋亡,抑制细胞增殖。

茅苍术转录因子AlWRKY65的克隆与功能初探

WRKY转录因子是植物特有的一类转录因子,在植物多种生理过程中发挥重要的作用。本研究以茅苍术转录组数据为依据,对茅苍术AlWRKY基因与AlTPS基因的FPKM值进行相关性分析,结合分析结果筛选出与AlTPS1、AlTPS6基因表达量具有显著正相关性且FPKM值相对较高的候选基因AlWRKY65,对该候选基因进行克隆,获得AlWRKY65基因的开放阅读框(ORF),分析其编码蛋白的相关信息并进行基因表达研究。研究结果表明,AlWRKY65包含一个681bp的开放阅读框,编码226个氨基酸。AlWRKY65基因编码的氨基酸序列与向日葵HaWRKY65、莴苣LsWRKY65等植物基因编码的氨基酸序列具有较高同源性;该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域,属于WRKY基因家族的第IIe组;系统进化树分析显示,茅苍术AlWRKY65与洋蓟CcWRKY65蛋白亲缘关系较近;运用实时荧光定量PCR检测AlWRKY65基因在2个产地不同组织中的表达水平,结果表明,不同产地的茅苍术AlWRKY65基因具有组织表达差异性,均在叶片中表达量较高;在茉莉酸甲酯(MeJA)诱导处理48 h内,AlWRKY65基因的表达量下调;亚细胞定位和转录自激活活性分析显示,AlWRKY65定位于细胞核,不具有自激活活性。这些结果为进一步研究AlWRKY65在茅苍术中的生物学功能提供参考。