蝴蝶兰WRKY57基因的克隆、亚细胞定位及响应脱落酸功能分析

WRKY转录因子是植物生长发育及胁迫反应的重要调节因子,然而关于蝴蝶兰(Phalaenopsis aphrodite)WRKY家族的功能知之甚少。以蝴蝶兰品种满天红为试验材料,分析蝴蝶兰转录因子PaWRKY57的理化特性、亚细胞定位、组织表达及在脱落酸(ABA)处理下的响应机制,结果表明,从P.aphrodite克隆得到的PaWRKY57长度为2049 bp,编码682个氨基酸,为不稳定的亲水蛋白,亚细胞定位显示PaWRKY57位于细胞核内。结构域分析和同源性比较表明,PaWRKY57蛋白具有WRKYGQK结构域,属于WRKY家族Ⅲ型亚家族;系统发育分析表明,PaWRKY57与水稻OsWRKY47亲缘关系最近。qRT-PCR分析显示,PaWRKY57在叶片中表达水平最高,在ABA处理下表现出“升—降—升—降”的表达模式。与野生型品系(WT)相比,PaWRKY57过表达植株的抑生植物激素(ABA、GAs)含量增加,叶绿素与促生植物激素(BR、IAA)含量降低,从而导致叶片黄化明显、植株衰老加快;在此基础上喷施ABA后,上述现象进一步加剧。综上,PaWRKY57是一个响应ABA信号的转录因子,受ABA信号介导调控蝴蝶兰的衰老过程。

马铃薯StWRKY51基因的克隆及在高温胁迫下的表达分析

为研究马铃薯StWRKY51基因在高温胁迫下的响应特性,利用RT-PCR技术从Russet Burbank马铃薯叶片中克隆得到StWRKY51基因,并对其进行了生物信息学分析和高温胁迫下的表达分析。结果表明,马铃薯StWRKY51基因开放阅读框为696 bp,编码231个氨基酸,与潘那利番茄、番茄和辣椒的氨基酸序列相似性高于80%。生物信息学分析表明,StWRKY51属于酸性稳定亲水性蛋白,其二级结构元件中无规则卷曲比例最高达63.64%。结构域分析显示,StWRKY51含有1个典型的WRKY保守结构域,锌指结构为C2H2型,属于第II亚家族。荧光定量PCR结果显示,马铃薯StWRKY51基因在高温处理后被显著诱导表达,表明StWRKY51基因可能在马铃薯抵御高温胁迫中起到一定的调控作用。该结果为进一步探究StWRKY51在马铃薯热胁迫中发挥的功能提供参考。

荔枝LcWRKY47基因的克隆、亚细胞定位、表达及延缓果实褐变的功能初探

荔枝(Litchi chinensis Sonn.)是亚热带地区重要的经济作物之一,但荔枝采后难贮存、易褐变,是目前保鲜过程中存在的最大问题之一。WRKY家族是植物中常见的一类转录因子,主要调控植物的逆境胁迫响应以及成熟衰老等生理过程。为了探究WRKY对采后荔枝果实成熟衰老的影响,本研究以妃子笑荔枝为试验对象,克隆LcWRKY47基因,长度为1077 bp;LcWRKY47编码的蛋白中含有WRKY保守结构域,二级结构以无规则卷曲为主,占比65.64%,三级结构主要为无规则卷曲和α-螺旋。通过motif分析及多序列比对,发现LcWRKY47蛋白属于第Ⅱ类WRKY转录因子;系统进化分析树表明荔枝LcWRKY47与同为无患子科的龙眼DlWRKY47亲缘关系最近;亚细胞定位试验表明,LcWRKY47蛋白定位在细胞核中;RT-qPCR分析表明,2mmol/L草酸处理后LcWRKY47基因在荔枝果皮和果肉中的表达趋势相同,均先升后降,后期处理组表达量均显著高于对照组,推测草酸处理后该转录因子在荔枝果实成熟衰老过程中起正调控作用。过表达LcWRKY47基因发现,转基因果实中LcWRKY47的表达量显著高于对照果实,且转基因荔枝衰老褐变情况明显优于处理组。综上推测,LcWRKY47转录因子可能在荔枝衰老与褐变过程中起着调节作用。

滇牡丹PdMYB57基因克隆及功能验证

【目的】滇牡丹作为牡丹育种材料,具有丰富的花色资源,研究其MYB转录因子对花色的调控作用可为牡丹花色分子育种工作提供帮助。【方法】以黄色及红色滇牡丹花部组织为材料进行徒手切片,并以其转录组数据为基础进行序列比对,得到1个MYB转录因子编码基因PdMYB57。经基因克隆、系统进化树构建、定量逆转录聚合酶链式反应(qPCR)、瞬时表达及高效液相色谱(HPLC)等验证该基因功能。【结果】PdMYB57基因有1个798 bp的完整开放阅读框,编码265个氨基酸,为亲水性不稳定蛋白;与拟南芥SG6亚族及卵叶牡丹PqMYB113、牡丹PsMYB57/PsMYB58及葡萄VvMYBA1/VvMYBA2等MYB转录因子聚为一簇,具有R2R3保守结构域[R/K]Px[P/A/R]xx[F/Y]基序;其在红色花滇牡丹萼片及黄色花滇牡丹叶片中高表达;其瞬时表达后能使烟草叶片产生紫色,HPLC表明其瞬时表达的烟草叶片中含有矢车菊素3-O-芸香糖苷(Cy3R)。【结论】PdMYB57基因编码1个R2R3-MYB转录因子,其表达具有组织特异性,并能促进植物花青素合成。

小麦WRKY转录因子TaWRKY72B的克隆、亚细胞定位及表达分析

WRKY蛋白是一类转录因子,参与调控植物的多种生长发育和胁迫应答过程。为进一步探究WRKY在小麦响应逆境中的作用,本研究克隆了小麦中国春的TaWRKY72B基因,并对其进行了生物信息学、亚细胞定位和表达模式分析。结果表明,中国春的TaWRKY72B基因编码320个氨基酸,蛋白序列包含典型的WRKY保守结构域和C2H2锌指结构,分子量为33.94 kDa,理论等电点为6.60,是酸性亲水的不稳定蛋白,无信号肽序列,属非跨膜蛋白。二级结构预测表明,TaWRKY72B主要由无规则卷曲(61.25%)、α-螺旋(23.12%)、延伸链(11.88%)和β-转角(3.75%)组成。TaWRKY72B定位于细胞核,符合转录因子特征。系统进化树分析显示,TaWRKY72B蛋白与节节麦、大麦和水稻等禾本科作物的WRKY亲缘关系较近。启动子顺式作用元件预测结果表明,该基因含有多个与生长发育、激素信号途径以及非生物胁迫应答相关的顺式调控元件。TaWRKY72B表达受激素、高温、低温和盐诱导,推测该基因可能参与小麦逆境胁迫应答和多种激素信号途径。

龙眼DlWRKY57基因克隆与拟南芥遗传转化

以龙眼成熟叶片为材料,利用实验室构建的龙眼转录组数据库,筛选出Dl WRKY57基因c DNA序列,对其开放阅读框(ORF)进行克隆和生物信息学分析。结果表明,Dl WRKY57基因ORF长度为894 bp,编码297个氨基酸,此蛋白属于WRKY基因家族中的域a类,存在1个WRKY结合位点。通过生物信息学分析表明,该蛋白属于非跨膜亲水蛋白,预测定位于细胞核,存在45个氨基酸磷酸化位点。其二级结构由无规则卷曲、琢-螺旋和延伸链构成,其中无规则卷曲为二级结构中最主要的结构元件,并且二级结构与三级结构预测结果高度一致。同源基因进化树分析表明该基因与木薯亲缘关系最近。以p MD18-T和p BI121载体为基础,成功构建了植物超表达载体p BI121-Dl WRKY57,利用农杆菌花序法转化拟南芥,经PCR分子检测,获得含Dl WRKY57基因的拟南芥植株,该超表达载体的遗传转化为Dl WRKY57基因功能的深入研究提供依据。

转录因子基因TaWRKY72b-1的克隆、表达及在烟草中表达对植株磷效率的影响

在富集低磷胁迫特异表达基因的小麦根系cDNA差减杂交文库中,鉴定了1个与拟南芥WRKY75同源的小麦WRKY型转录因子基因表达序列标签(EST)。依据该EST序列高度同源的小麦WRKY72b序列,克隆了对应基因TaWRKY72b-1。TaWRKY72b-1与WRKY72b在cDNA序列上有2个碱基的差异,但编码氨基酸没有改变。TaWRKY72b-1开放阅读框为621bp,编码206个氨基酸残基,氨基酸组成上含有保守的WRKY基序和C2H2基序。系统进化分析表明,TaWRKY72b-1与小麦WRKY72a和大麦WRKY12可能来自相同的祖先。与对照供磷水平(2mmol L-1P)相比,低磷处理使根叶中TaWRKY72b-1的转录本数量均明显增多。表明TaWRKY72b-1对低磷胁迫逆境产生了明显的应答作用。TaWRKY72b-1在烟草中表达表明,低磷胁迫条件下,高表达TaWRKY72b-1的烟草植株干重、单株磷累积量和磷利用效率均较对照明显增加。因此,TaWRKY72b-1基因在改善低磷胁迫下作物的磷效率中可能具有较重要的应用价值。

干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片SSH文库构建及CkWRKY1基因克隆

为研究柠条锦鸡儿抗旱的分子机制,挖掘干旱响应相关基因,成功构建干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片的抑制性差减杂交(SSH)文库,获得1286条高质量的EST序列,平均长度475bp,拼接得到Unigenes645条。对这些Unigenes进行Blast比对注释后发现很多抗旱相关基因,例如LEA蛋白、DHN蛋白编码基因,MYB、bZIP、WRKY、NAC和bHLH转录因子等。通过RACE技术克隆其中1个WRKY转录因子的cDNA全长,命名为CkWRKY1,GenBank登录号为JX987095。CkWRKY1编码330个氨基酸的蛋白质,氨基酸序列中有1个"WRKYGQK"的WRKY转录因子家族保守序列,属于第Ⅱ类WRKY转录因子。利用实时荧光定量PCR技术检测发现,CkWRKY1基因在干旱处理后mRNA的表达水平明显上升,预示该转录因子可能与柠条锦鸡儿抗旱的分子机制相关。

核桃WRKY4基因的克隆与表达分析

WRKY转录调控因子广泛参与植物的生长发育、生物胁迫和非生物胁迫等生理过程。本研究利用reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)及rapid amplification of cDNA ends(RACE)技术克隆了核桃(Juglans regia L.)WRKY基因cDNA全长序列,命名为WRKY4(GenBank登录号为KC795551.1)。结果表明,克隆到的片段长度为2 174 bp,完整开放阅读框为1 554 bp,编码517个氨基酸。序列分析表明WRKY4基因含有2个WRKY保守结构域和2个C2H2锌指结构域,属于WRKY基因家族第Ⅰ类成员。利用实时荧光定量PCR分析4℃低温和自然低温条件对该基因表达的影响以及组织表达模式。结果表明WRKY4受低温诱导表达,能够在低温胁迫的早期响应这一生理过程。WRKY4在树皮(韧皮部)、雌花、花芽和叶片中均有表达,且在树皮中表达量最高,具有组织特异性。研究结果可为核桃抗寒基因工程育种提供基因资源。

15个普通小麦WRKY基因的克隆与表达分析

WRKY转录因子广泛参与了植物对生物与非生物胁迫应答反应、激素响应以及生长发育等一系列生理活动.但是,对小麦WRKY家族基因目前还缺少系统的克隆、表达和功能研究.文中采用EST的电子拼接方法,克隆了15个具有完整开放阅读框的小麦WRKY基因,分属于WRKY家族的3个大类.表达分析发现,除TaWRKY10基因在分蘖节中表达最强外,其他基因的表达水平都是在叶中最高;4个基因随着叶片的成熟和衰老表达量显著增强;8个基因对低温、高温、NaCl或PEG等逆境因子具有响应;另外,WRKY基因在小麦杂交种与亲本之间存在明显的表达差异,并且有些基因对PEG逆境因子的响应在杂种比在亲本中快.表明,小麦WRKY基因参与了叶片衰老和逆境胁迫的响应过程,所检测到WRKY基因在杂种和亲本中的表达差异可能会通过增强杂交种的抗逆性而促进小麦杂种优势的产生.

陆地棉三个WRKY基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生长发育以及对外界环境的反应中起着重要的调控作用,目前对棉花WRKY家族基因的研究比较少。本研究利用电子克隆的方法,从陆地棉品种山农圣杂3号中克隆得到了3个具有完整开放阅读框的棉花WRKY基因,聚类分析表明它们同属于WRKY家族中的第Ⅱ类。利用RT-PCR结果表明:250mmol/LNaCl盐胁迫和20%PEG6000干旱胁迫下同时诱导GhWRKY4的基因表达,GhWRKY5仅受干旱胁迫下的诱导,而GhWRKY6对这两种逆境胁迫都没有变化。

湖北海棠MhWRKY42基因克隆及表达分析

从湖北海棠上克隆到1个WRKY基因,开放阅读框(ORF)长度为1 818个核苷酸,编码606个氨基酸。该基因氨基酸序列与拟南芥AtWRKY42的一致性为39.38%,具有WRKY基因家族典型保守结构域,即N端为WRKYGQK,C端为Cx4-5Cx22-23HxH;蛋白三级结构和拟南芥AtWRKY42相似,具有4个β折叠;系统进化树上与AtWRKY42聚在同一分支,属于WRKY基因家族GroupⅡb成员,命名为MhWRKY42(GenBank登录号:JX112905)。实时荧光定量RT-PCR分析表明,MhWRKY42基因在各个器官中都有表达,其中在果实中表达量最高,根和总花次之;在花中,以花萼表达量最高,子房和雄蕊次之;其受盐、低温、苹果白粉病诱导表达;外源IAA处理诱导其下调表达;而MhWRKY42基因表达受ABA、水分胁迫的影响小。

巨桉EgrWRKY70基因克隆和初步表达分析

WRKY家族为植物所特有,参与调控植物逆境胁迫、生长发育和衰老等生物学过程。为了获得WRKY70同源基因在桉树响应胁迫中的作用和功能,克隆巨桉(Eucalyptus grandis)中的Egr WRKY70基因,通过生物信息学分析和q RT-PCR进行功能的初步鉴定。结果表明,Egr WRKY70基因编码321个氨基酸,蛋白分子量为36.18 ku,只有一个WRKY结构域,属于WRKY转录因子III a类成员。同时,Egr WRKY70与麻风树的Jcu WRKY70的亲缘关系最近,其氨基酸序列相似性达到58.2%。半定量RT-PCR分析表明,Egr WRKY70主要在巨桉叶片、根和花中表达,而在茎部表达量较低。实时定量q RT-PCR分析显示:Egr WRKY70基因在低温和盐胁迫下,表达量快速升高然后下降;在盐胁迫下Egr WRKY70基因表达仍然维持在较高水平;在油菜素内酯和水杨酸处理时,Egr WRKY70基因能够快速的响应,使用茉莉酸甲酯处理时其表达量没有发生明显的变化。由此表明,Egr WRKY70能够通过不同的响应方式参与桉树生物和非生物胁迫的应答。

青花菜转录因子基因BoWRKY2的克隆与表达分析

以青花菜为材料,克隆到1个WRKY转录因子基因Bo WRKY2,在序列分析的基础上,利用反转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测其在核盘菌和霜霉菌侵染下的表达模式.结果表明:Bo WRKY2的基因组全长为1 507 bp,具有2个内含子,编码区全长为987 bp;Bo WRKY2编码328个氨基酸,具有1个WRKYGQK残基和C-X5-C-X23-H-X1-H锌指结构,WRKY结构域与甘蓝型油菜的最为相似,仅存在1个氨基酸残基的差异.进化分析结果表明,Bo WRKY2与同为十字花科的甘蓝型油菜、拟南芥、深山南芥、荠菜和盐芥聚为一组,支持率达97%.RT-PCR结果表明,Bo WRKY2的表达受霜霉菌和核盘菌的诱导,二者的表达模式相似,在6 h和12 h时表达量增加,但在24 h后下降,暗示Bo WRKY2与2种病菌的早期抗性反应相关.

番茄WRKY基因的克隆与分析

WRKY转录因子可调控下游抗逆基因的表达,进而在植物生物和非生物胁迫中起重要作用。以水杨酸诱导的番茄为材料,设计简并引物后进行RT-PCR扩增,得到4个含有WRKY结构域的EST。选择其中之一,采用同源克隆的方法扩增出WRKY基因的全长。半定量PCR分析结果表明,400 mmol/L NaCl、4℃低温胁迫后该基因表达量发生变化,说明其可能与番茄的耐盐性和耐低温性有关。

巴西橡胶树WRKY转录因子基因HbWRKY41的克隆与表达分析

为阐明巴西橡胶树WRKY转录因子基因Hb WRKY41的分子特征及表达特性,利用RT-PCR方法从巴西橡胶树中克隆了该基因。Hb WRKY41开放阅读框1 020 bp,编码339个氨基酸,预测蛋白分子量为38.48 k Da,理论等电点为5.52。Hb WRKY41含有1个WRKY保守结构域和1个C_2HC型锌指结构,与蓖麻、棉花、大豆及拟南芥WRKY41蛋白聚为一类,属于Ⅲ类WRKY转录因子家族成员。实时荧光定量PCR检测结果表明,Hb WRKY41在巴西橡胶树根、树皮、胶乳、叶和花等组织中均有表达,以在衰老叶片中的表达最高,而在胶乳和树皮中的表达相对较低。干旱、低温及高盐胁迫均可上调Hb WRKY41的表达,其中以低温或盐胁迫下Hb WRKY41的表达持续升高。Hb WRKY41可能在巴西橡胶树叶片衰老和非生物胁迫应答中起着重要调控作用。

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。

云南普通野生稻和地方稻WRKY45基因的克隆及转化

以云南地方稻‘三磅七十箩’(SB70)和景洪普通野生稻为材料,根据GenBank中水稻WRKY45基因序列设计引物,进行PCR扩增。结果表明,经测序得到目的基因长约1.3kb,推导的氨基酸具有WRKY蛋白典型的保守区域WRKYGQK。经BLAST分析,与GenBank中不同栽培稻WRKY45基因的相似性在85%以上,但也存在一些核苷酸差异,这些差异可能导致其调控抗逆能力更强。构建该基因的表达载体pCAMBIA1300,重组克隆后通过农杆菌介导法转入云南栽培粳稻‘云资粳41号’中,经PCR鉴定获得24株转基因阳性植株。

茄子SmWRKY1转录因子基因克隆及序列分析

克隆茄子转录因子SmWRKY1基因,对其序列进行分析,为SmWRKY1基因在茄子抗逆分子育种的应用中提供理论依据。以茄子幼苗为试材,依据GenBank上已提交的番茄、甜椒、烟草的WRKY基因序列设计引物,提取总RNA利用RT-PCR方法扩增得到基因片段,克隆、测序并通过NCBI在线和DNAMAN等软件对其核酸及氨基酸序列进行分析。同源克隆得到SmWRKY1,核酸序列930 bp,翻译为310个氨基酸组成的蛋白序列,其中Ser和Thr量最多,分别占总氨基酸数的12.0%和11.0%。NCBI检索SmWRKY1属于WRKY基因超家族,第114至120个氨基酸含有WRKY保守结构域"WRKYGQK",其锌指结构为C2H2型,初步证实SmWRKY1属于第二大类WRKY转录因子。DNAMAN构建茄子SmWRKY1与不同植物WRKY蛋白的系统发育树,表明茄子WRKY1与番茄中的WRKY1蛋白亲缘关系最近,同源性达96%。WRKY基因在植物耐逆性的研究中有着重要的作用,通过克隆出SmWRKY1基因片段,为进一步克隆其全长、研究其功能做前期准备,为分子育种、培育茄子耐逆性新品种奠定了一定的基础。

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。