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枸橼C-05 CmPR4A上游转录因子CmWRKY75的筛选及其抗溃疡病功能分析
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作者 颜培涵 罗健铭 +7 位作者 郝晨星 孙紫青 叶蓉春 李益 刘恋 盛玲 马先锋 邓子牛 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第21期4304-4317,共14页
【背景】柑橘溃疡病(Citrus canker)是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonascitrisubsp.citri,Xcc)引起的危害严重的柑橘病害之一,目前尚无根治方法,而现有栽培品种中很少有对柑橘溃疡病存在显著抗性的品种,因此,抗病品种的选育对根治... 【背景】柑橘溃疡病(Citrus canker)是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonascitrisubsp.citri,Xcc)引起的危害严重的柑橘病害之一,目前尚无根治方法,而现有栽培品种中很少有对柑橘溃疡病存在显著抗性的品种,因此,抗病品种的选育对根治该病害尤其重要,而抗性基因的发掘又非常利于抗病育种。【目的】以枸橼C-05的抗溃疡病相关基因CmPR4A为诱饵,筛选其上游转录因子,探究转录因子参与调控枸橼C-05抗溃疡病的功能作用,为选育柑橘抗病品种提供基因信息。【方法】基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果,结合实时荧光定量PCR分析PR4A在抗病和感病种质中的表达差异,使用PlantCARE对枸橼C-05(抗病)和冰糖橙(感病)PR4A启动子序列进行差异分析,利用酵母单杂交筛选PR4A上游转录因子,并使用酵母回转验证、双荧光素酶验证CmPR4A和候选转录因子的互作关系。在8种抗病和感病柑橘种质中,人工接种Xcc后,于0、2、4、6和8 d时取注射点附近的叶片,对转录因子的表达水平进行分析,验证其与抗病的关系。通过农杆菌介导瞬时转化法,将带有35S启动子的转录因子载体在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达,使用qRT-PCR对转录因子和PR4A表达水平进行分析,并在瞬时过表达24 h后接种Xcc,进行Xcc菌定量和症状观察。【结果】接种Xcc的枸橼C-05和冰糖橙的转录组分析及定量PCR表达结果显示,在接种4、6和8 d时,抗病种质枸橼C-05中的PR4A表达量显著高于感病的冰糖橙。枸橼C-05和冰糖橙的PR4A启动子在-236bp处存在顺式作用元件W-box的差异,以此为依据进行CmPR4A启动子短截并构建诱饵载体。依据自激活结果,在200 ng·mL-1的金担子素(AbA)浓度下,以proCmPR4A-2为诱饵,在枸橼C-05受Xcc诱导下的酵母文库中进行酵母单杂交筛选,表明CmWRKY75可以与proCmPR4A-2互作,双荧光素酶报告系统也证实二者的互作关系,且CmWRKY75正调控CmPR4A的表达。在8种柑橘种质叶片接种Xcc后进行WRKY75的表达模式分析表明,WRKY75表达量在抗病种质枸橼C-05、美国枸橼AV、矮果香橼中显著上调,在感病种质冰糖橙、沙田柚及柠檬、南川香橼和丹娜香橼中只出现微量上调。在枸橼C-05和冰糖橙叶片中瞬时过表达WRKY75,发现PR4A的表达量在接种4d时显著上调且能增强叶片对Xcc的抗性。【结论】CmWRKY75可以结合到CmPR4A启动子的W-box上,并正调控CmPR4A的表达,增强叶片对Xcc的抗性。同时WRKY75的表达受Xcc诱导,在抗病种质中呈显著上调表达,与PR4A在抗病感种质中的表达变化趋势一致,可能是上游调控因子WRKY75在不同抗病和感病柑橘种质中表达差异导致,从而使其在枸橼C-05抗溃疡病过程中起作用。 展开更多
关键词 柑橘溃疡病 枸橼C-05 PR4A 转录因子 wrky75
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柑橘抗逆基因WRKY75的克隆与表达分析 被引量:9
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作者 卢婷 杨莉 +5 位作者 胡威 匡柳青 郭文芳 沈丹 刘德春 刘勇 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期82-93,共12页
【目的】低温、干旱、高盐等非生物胁迫严重限制柑橘的生长发育和地理分布。转录因子可以调控下游抗逆基因表达,在植物响应非生物胁迫的过程中起了重要的作用。WRKY是植物中重要的转录因子家族之一,其家族成员在植物抗逆过程中起着重要... 【目的】低温、干旱、高盐等非生物胁迫严重限制柑橘的生长发育和地理分布。转录因子可以调控下游抗逆基因表达,在植物响应非生物胁迫的过程中起了重要的作用。WRKY是植物中重要的转录因子家族之一,其家族成员在植物抗逆过程中起着重要的作用。为研究WRKY转录因子在柑橘抗逆中的功能。【方法】以柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]、甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck.]、金柑[Fortunella margarita(Lour.)Swingle.]和芦柑[Citrus reticulata Blanco.]等柑橘品种的实生苗为试验材料,通过电子克隆和RT-PCR的方法从4种材料中克隆到4个新的WRKY家族基因,分别命名为ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75、CrWRKY75,并对其进行生物信息学和不同组织及胁迫处理下的表达模式分析。【结果】生物信息学分析结果显示ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75的cDNA序列全长分别为702,702,705,705 bp,分别含有582,582,585,585 bp的开放阅读框(Open reading frame,ORF),分别编码193,193,194,194个氨基酸;推测其蛋白分子质量分别为21.73、21.67、21.80和21.80 ku,等电点分别是9.33、9.25、9.25和9.25,且均含有WRKY家族的保守结构域(1个WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构域)。多序列比对发现,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75蛋白与克莱门柚CcWRKY75、苹果MdWRKY75、可可TcWRKY75和葡萄VvWRKY75同源性高于90%。系统进化树分析结果表明,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和Cr WRKY75与克莱门柚CcWRKY75的亲缘关系最近,与烟草NtWRKY75的亲缘关系较远。亚细胞定位预测结果表明,ClWRKY75、CsWRKY75、FmWRKY75和CrWRKY75蛋白均定位于细胞核。蛋白二级结构预测结果显示,4种WRKY75蛋白含无规则卷曲结构39.18%~52.33%,α-螺旋结构29.02%~35.05%,延伸链结构10.36%~13.92%,β-转角结构8.29%~11.86%。实时荧光定量PCR(Realtime quantitative PCR,qPCR)分析显示,4℃低温处理能提高4个柑橘WRKY75基因表达。而20%PEG6000模拟干旱处理只能提高FmWRKY75和CrWRKY75表达量。250 mmol/L NaCl胁迫处理只能提高CsWRKY75和FmWRKY75表达量。【结论】结果表明柠檬ClWRKY75、甜橙CsWRKY75、金桔FmWRKY75和芦柑CrWRKY75是WRKY基因家族的成员,且受多种非生物胁迫诱导表达,推测其可能在柑橘响应非生物胁迫过程中发挥了重要作用,该研究结果为进一步研究柑橘抗逆的分子机制提供理论参考。 展开更多
关键词 柑橘 wrky75 非生物胁迫 基因克隆 表达分析
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AtWRKY75 positively regulates age-triggered leaf senescence through gibberellin pathway 被引量:1
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作者 Haiyan Zhang Liping Zhang +3 位作者 Songguo Wu Yanli Chen Diqiu Yu Ligang Chen 《Plant Diversity》 CSCD 2021年第4期331-340,共10页
WRKY transcription factors play essential roles during leaf senescence.However,the mechanisms by which they regulate this process remains largely unknown.Here,we identified the transcription factor WRKY75 as a positiv... WRKY transcription factors play essential roles during leaf senescence.However,the mechanisms by which they regulate this process remains largely unknown.Here,we identified the transcription factor WRKY75 as a positive regulator during leaf senescence.Mutations of WRKY75 caused a delay in agetriggered leaf senescence,whereas overexpression of WRKY75 markedly accelerated this process.Expression of senescence-associated genes(SAGs)was suppressed in WRKY75 mutants but increased in WRKY75-overexpressing plants.Further analysis demonstrated that WRKY75 directly associates with the promoters of SAG12 and SAG29,to activate their expression.Conversely,GAI and RGL1,two DELLA proteins,can suppress the WRKY75-mediated activation,thereby attenuating SAG expression during leaf senescence.Genetic analyses showed that GAI gain-of-function or RGL1 overexpression can partially rescue the accelerated senescence phenotype caused by WRKY75 overexpression.Furthermore,WRKY75 can positively regulate WRKY45 expression during leaf senescence.Our data thus imply that WRKY75 may positively modulate age-triggered leaf senescence through the gibberellin-mediated signaling pathway。 展开更多
关键词 wrky75 Leaf senescence GA DELLAs
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