Ⅰ型骨质疏松症患者长链非编码RNA WT1-AS与骨密度关系

目的探讨Ⅰ型骨质疏松症(OP)患者血清长链非编码RNA(lncRNA)WT1-AS水平与骨密度(BMD)及骨代谢指标的相关性。方法纳入2018年9月—2020年9月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的女性Ⅰ型OP患者108例(OP组),同期绝经后骨量减少者114例(骨量减少组)以及同期年龄相符的绝经后非OP女性120例(对照组)。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定研究对象血清lncRNA WT1-AS水平,采用酶联免疫法测定骨代谢指标,包括血清骨钙素(OCN)、β-胶原降解产物(β-CTX)和Ⅰ型原胶原N端前肽(PINP)。采用Pearson法分析OP患者血清lncRNA WT1-AS与BMD及骨代谢指标相关性,采用logistic回归法分析影响OP发生的因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA WT1-AS对OP的诊断价值。沉默大鼠前成骨细胞的lncRNA WT1-AS表达,观察lncRNA WT1-AS对前成骨细胞分化和矿化的作用。结果与对照组和骨量减少组相比,OP组OCN水平降低,β-CTX、PINP水平和lncRNA WT1-AS相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。OP患者血清lncRNA WT1-AS水平与BMD(L_(1~4)和股骨颈)、OCN水平呈负相关(r=-0.542、-0.557、-0.608),与β-CTX、PINP水平呈正相关(r=0.576、0.595)。血清lncRNA WT1-AS水平是影响OP发生的危险因素。血清lncRNA WT1-AS水平诊断OP的ROC曲线下面积(AUC)为0.796,特异度为92.11%,灵敏度为62.96%。沉默大鼠前成骨细胞的lncRNA WT1-AS表达,可促进矿化结节生成。结论Ⅰ型OP患者血清lncRNA WT1-AS异常高表达与BMD、骨代谢有关,且影响Ⅰ型OP的发生,对OP具有一定的诊断价值。

WT1基因在NSCLC中的表达及其临床意义

目的探讨Wilms tumor gene 1(WT1)基因在非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)中的表达及其临床意义。方法通过实时荧光定量PCR技术检测100例NSCLC组织石蜡标本及对照标本(40例癌旁组织和40例良性病变组织)中WT1基因的表达量,以对照组WT1相对表达量均值为比较标准,将癌组织WT1表达量分为高表达和低表达;分析WT1表达量与NSCLC患者临床特征、生存期之间的关系。结果与对照组组织比较,WT1基因在NSCLC组织中高表达[(4. 295±1. 477) vs (1. 001±0. 002),P <0. 01]。WT1基因表达在NSCLC患者病理类型[(4. 132±0. 576) vs (6. 118±0. 525)]、分化程度[(3. 973±0. 329) vs (5. 683±0. 383)]、TNM分期[(4. 829±0. 137) vs (5. 685±0. 473)]和淋巴结转移[(3. 165±0. 499) vs (5. 186±0. 618)]方面比较,差异均具有统计学意义(均P <0. 01)。WT1高表达患者(WT1表达≥1. 001)生存期缩短(43个月vs 59个月,P=0. 002)。结论WT1基因在NSCLC组织中高表达,且高表达能够促进NSCLC分化和转移,缩短患者生存期。

NB4细胞诱导分化过程中WT1(17AA+/-)剪接变异体表达的研究

目的 探讨WT1(17AA+/-)剪接变异体表达的改变与NB4细胞诱导分化的关系。方法 建立了实时定量RT PCR方法检测看家基因GAPDH、WT1基因及其WT1(17AA+)剪接变异体的表达水平,以同一份标本(WT1拷贝数/GAPDH拷贝数)×104来计算WT1表达水平,定义为WT1N(normalizedWT1expressionlevel),同样定义WT1(17AA+)N,并用流式细胞仪检测NB4细胞表面抗原CD11b的变化。结果 随着NB4细胞向粒系终末分化WT1基因及其WT1(17AA+)剪接变异体的表达水平迅速下降,全反式维甲酸(ATRA)作用0,6,12,18,24,48,72h后WT1N的平均表达水平分别为191.11, 121.17, 66.72, 43.47,18.29,4.04和3.79,WT1(17AA+) N剪接变异体的表达水平分别为105.12,46.89,20.50,10.38,8.85,2.16和1.92,两者均与CD11b的变化呈负相关(r=-0.65, P<0.01;r=-0.77,P<0.01),而且值得注意的是在ATRA作用后开始的18h内,WT1(17AA+)N /WT1N比值逐渐下降,24h后与药物作用前水平无统计学差异,表明在ATRA诱导NB4细胞分化早期以WT1(17AA+)剪接变异体表达下降为主。结论 WTl基因高表达与NB4白血病细胞分化阻滞有关,WT1(17AA+)剪接变异体可能在分化阻滞中起主要作用。

维甲酸诱导HL-60细胞分化过程中WT1基因表达及其异构体比例变化的研究

目的探讨全反式维甲酸（ATRA）诱导HL_60细胞分化过程中WT1基因及其异构体表达水平及比例变化。方法采用ATRA诱导HL-60细胞分化，以硝基四氮唑蓝（NBT）还原实验及细胞免疫标记CD11b检测判断细胞分化程度；即时荧光定量RT—PCR方法检测HL-60细胞在诱导分化过程中总WT1、WT1（17AA＋）及WTI（KTS＋）的表达，并计算出WT1（＋／＋）、WT1（＋／-）、WT1（一／＋）、WT1（-／-）四种异构体的比例。结果ATRA诱导HI。60细胞分化过程中NBT阳性率及CD11b表达阳性率与诱导分化前（0h）相比均显著增加（P〈0．05，P〈0．001）。随着细胞分化，WT1表达水平由0h的（4．17±2．21）×10^-3降低至96h的（7．53±2．30）×10^-4；17AA＋和KTS＋两类异构体的比例也逐渐下降，17AA＋异构体比例由0h的0．60±0．05降到96h的0．42±0．08（P〈0．05）。KTS＋异构体比例由0．53±0．08降至96h的0．41±0．04（P〈0．05）；四种异构体的比例变化表现不一致，WT1（＋／＋）比例由0h的0．32±0．06降至96h的0．17±0．03，而WT1（-／-）比例由0h的0．19±0．04升至96h的0．34±0．05，另外两类异构体比例变化差异无统计学意义。结论ATRA诱导HL60细胞分化过程中总WT1表达水平逐渐降低，分化前异构体以WT1（＋／＋）为主，而分化后以WT1（-／-）为主，提示WT1基因可能通过调节四种异构体比例而发挥抑制或促进分化的作用。

急性髓性白血病骨髓细胞NF-κB活性及其与WT1和Bcl-2表达的关系

目的探讨核因子κappa B(NF-κB)的活性在急性白血病发病及疗效中的意义及其与W ilm s肿瘤基因(WT1)、B细胞淋巴瘤基因(Bc l-2)表达的关系。方法用EMSA方法检测43例急性髓性白血病病人(分初治、难治及完全缓解组)和30例对照骨髓细胞中NF-κB的活性,用RT-PCR方法检测了各组病人骨髓细胞中WT1、Bc l-2基因的mRNA表达水平。结果急性白血病难治组NF-κB活化明显高于初治组,初治组又明显高于完全缓解组,差异有统计学意义;对照组未检测到NF-κB活化;NF-κB活性与WT1、Bc l-2的表达水平两两之间均呈正相关(r=0.909,P<0.01;r=0.494,P=0.037)。结论NF-κB的活性及WT1、Bc l-2的表达水平与急性白血病的发病及疗效有关。难治性白血病疗效差可能与NF-κB的活性及WT1、Bc l-2的表达水平增高有关。

多重实时荧光定量PCR同时检测急性白血病患者WT1和MDR1基因表达水平方法的建立

目的 构建可同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.方法 提取K562细胞的总RNA,并逆转录扩增WT1和MDR1的cDNA,通过Bam H Ⅰ及BglⅡ酶切后连接成WT1和MDR1重组片段,对WT1和MDR1重组片段进行PCR扩增,PCR产物纯化后与pMD18载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,构建载有WT1和MDR1基因的标准品重组质粒,用限制性核酸内切酶法和PCR法鉴定质粒.用FAM荧光标记MDR1探针、VIC荧光标记WT1探针,建立能在1个试管中同时检测WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR反应体系.应用该体系检测47例AL患者及32例对照者WT1和MDR1基因表达水平,比较两组之间WT1和MDR1基因表达水平的差异,并随访7例AL患者不同病程中WT1和MDR1基因表达水平的变化与临床预后的关系.结果 经EcoR1酶切及PCR法证实WT1和MDR1基因重组质粒已成功构建.所建立多重实时荧光定量PCR方法的灵敏度为102拷贝/μl;所建立标准曲线的R2分别为0.999和0.998.AL患者WT1和MDR1基因的表达水平中位数分别为37 000（163～6 370 000）拷贝/μg RNA和76 200（179～18 000 000）拷贝/μg RNA,显著高于对照组的258（0～643）拷贝/μg RNA和333（0～779）拷贝/μg RNA,差异有统计学意义（Z=6.755、6.736,P＜0.01）.对应用相同的诱导和巩固化疗方案治疗的7例AL患者进行随访,3例持续缓解患者中,WT1和MDR1的表达水平在初治时分别为2 170和86 900、1 130和5 860、1 170和586拷贝/μg RNA,治疗后WT1和MDR1的表达水平明显下降,分别为370和560、138和980、150和690拷贝/μg RNA,此3例患者获长期完全缓解.在3例完全缓解后复发患者中,WT1和MDR1表达水平在初治时分别为1 600和11800、24 800和968、48 200和1 100 000拷贝/μg RNA,在化疗获得完全缓解后均降低,但在随后治疗过程中,WT1、MDR1表达量又逐渐升高,分别为20 314和25 660、184 364和31 530、15 680和878 000拷贝/μg RNA,此3例患者最终均出现临床复发.另外1例未缓解患者初治时WT1和MDR1表达水平分别为81 600和1 200 000拷贝/μg RNA,化疗后WT1、MDR1表达水平不仅未下降,反而有所上升,分别为124 100和7 632 400拷贝/μg RNA,此例患者始终未获缓解.结论 本研究成功构建了可同时检测WT1和MDR1基因表达水平的多重实时荧光定量PCR方法.同时检测AL患者WT1和MDR1基因表达水平的变化可能有助于判断预后.

儿童肾母细胞瘤WT1基因突变四例报道

目的研究儿童肾母细胞瘤患者WT1基因的突变类型及突变频率。方法应用聚合酶链反应（PCR）扩增出54例儿童肾母细胞瘤患者WT1基因全部10个外显子及其相邻内含子序列，经纯化后进行PCR产物直接测序。结果4例患者WT1基因分别存在3个杂合无义突变及1个纯合错义突变。例1患者WT1基因7号外显子第1006位碱基A—T杂合突变，造成第336号氨基酸由赖氨酸转变为终止密码子，即K336X。例2患者WT1基因9号外显子第1168位碱基C—T杂合突变，造成第390号氨基酸由精氨酸转变为终止密码子，即R390X。例3患者WT1基因6号外显子第814位碱基G—T杂合突变，造成第272号氨基酸由谷氨酸转变为终止密码子，即E272X。例4患者WT1基因10号外显子第1228位碱基A—G纯合突变，造成第410号氨基酸由丝氨酸转变为甘氨酸，即S410G。结论散发的中国儿童。肾母细胞瘤患者册1基因外显子突变的发生率与国外报道相近，检测到的4例突变患者中3例为无义突变、1例为错义突变。

nephrin、血管内皮生长因子及其受体表达与先兆子痫大鼠蛋白尿的关系

目的 研究nephrin、血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）在先兆子痫大鼠肾组织的表达与蛋白尿的关系.方法 采用一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME）制备大鼠先兆子痫模型（n=8）,分别与正常雌性组（n=6）、正常妊娠组（n=8）、未孕L-NAME对照组（n=6）大鼠比较动脉收缩压（SBP）、尿蛋白量（24 h）.各组大鼠肾组织分别行光镜和电镜检查.Western印迹法、实时定量PCR检测nephrin在各组大鼠肾脏局部的表达;免疫荧光法检测各组大鼠肾小球内wilms肿瘤蛋白WT1的表达.Western印迹法检测VEGF及VEGFR（Flt-l、Flk-1）在各组大鼠肾脏局部的表达.结果 先兆子痫模型组大鼠nephrin蛋白的表达（0.0726±0.0074）显著低于正常雌性组（0.3795±0.0509）、正常妊娠组（0.2361±0.0437）及未孕L-NAME对照组大鼠（0.7265＋0.0503）（均P＜0.01）;而nephrin mRNA在各组大鼠间差异无统计学意义.各组大鼠足细胞数目差异无统计学意义.先兆子痫大鼠组VEGF的表达（1.5429±0.0898）显著高于正常雌性组（1.1870±0.1160）、正常妊娠组（1.3741±0.1165）、未孕L-NAME对照组大鼠（1.0155±0.0742）（均P＜0.01）;先兆子痫组大鼠VEGFR（Flt-1、Flk-1）的表达均显著高于其他各对照组大鼠（均P＜0.05）.结论 先兆子痫大鼠中,nephrin蛋白水平表达明显降低,肾脏局部VEGF-VEGFR表达显著增强,可能参与了先兆子痫蛋白尿的生成,其具体机制有待进一步研究.

宫内生长迟缓引起大鼠肾单位数目减少的机制研究

目的 探讨宫内生长迟缓（IUGR）引起肾单位数目减少的机制。方法 采用孕期全程低蛋白（6%蛋白）营养建立IUGR大鼠模型。选取IUGR新生雄鼠作为研究对象,采用Ki-67免疫染色和TUNEL法检测肾组织细胞的增殖和凋亡;实时定量PCR测定肾组织WT1、Bcl-2、Bax及p53的mRNA表达水平;免疫组织化学法及Western印迹法检测肾组织中WT1和Bcl-2蛋白质表达。2周龄时测定肾单位数目。结果 2周龄时,IGUR大鼠肾单位数目明显少于对照组（P＜0．01）。与对照组相比,IUGR新生鼠生肾区TUNEL阳性细胞数明显增多;肾脏WT1、Bcl-2 mRNA表达减少,Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比例降低．而p53 mRNA的表达差异无统计学意义;肾组织中WT1和Bcl-2蛋白质的表达量及在生肾区的分布也明显减少。结论 IUGR大鼠肾单位数目减少可能与肾发生中细胞凋亡增加相关,而WT1、Bcl-2表达减少,Bcl-2/Bax比例降低可能是细胞凋亡增加的分子机制之一。

Denys-Drash综合征三例临床病理特点

目的探讨Denys—Drash综合征（DDS）的临床病理特征，以加深对DDS的认识。方法总结2009至2011年诊治3例DDS患儿的临床病理特点和WT1检测结果，并结合文献复习。结果3例DDS，例1、例2为核型46XX、外生殖器正常女性，例3为男性伴双侧腹股沟隐睾。肾病起病年龄分别为1岁9个月、2岁4个月及3个月。例2、例3激素治疗无效。例1使用他克莫司，血浆白蛋白、胆固醇有改善，尿蛋白无缓解。例2用环孢素A、他克莫司蛋白尿均能缓解；现4岁9个月，蛋白尿缓解，肾功能正常。3例均是右肾单侧Wilms瘤，残肾病理均为弥漫系膜硬化。WT1检测：例1为外显子9的c．1213C〉G错义突变，为新突变；例2、例3分别为e．1168C〉T无义突变和c．1130A〉T错义突变。结论DDS肾病临床表现变化较大，起病多较早，肾衰竭常在4岁以前出现，少数起病及肾衰竭出现较晚。其蛋白尿对激素治疗无效，但对钙神经素抑制剂环孢素A有效；本研究2例患儿使用他克莫司亦有效。DDS多因WT1突变所致，肾脏病理主要为弥漫系膜硬化。

依那普利和限食对肥胖相关肾病大鼠足细胞损伤的干预作用

目的观察肥胖相关肾病（ORG）大鼠肾小球足细胞WT1表达，探讨依那普利和限食对ORG肾脏保护机制。方法高脂饲料喂养Wistar大鼠24周建立ORG模型后，分为对照组（A）、模型组（B）、依那普利治疗组（C）、限食组（D）、限食加依那普利组（E）继续饲喂8周，观察24h尿白蛋白（24hUA1b）、肾组织形态学及超微结构，免疫组化检测足细胞WT1表达（足细胞密度）。结果B组足细胞数和密度显著低于A组（P〈0．01），24hUA1b和肾小球硬化显著高于A组（P〈0．01）；C、D、E治疗组足细胞数和密度明显高于B组（P〈0．05，P〈0．01），24hUA1b和肾小球硬化较B组明显降低（P〈0．01），且E组联合疗效明显优于单个治疗组。结论ORG足细胞改变与蛋白尿程度和肾损伤呈一定相关性。依那普利加限食能明显抑制ORG足细胞WT1表达，减少尿蛋白，减轻肾损伤。