亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14亚硝酸盐还原酶的食品级高效诱导表达及其酶学性质研究

【目的】研究亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WU14亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,Nir S)的作用机制,为发酵食品中应用乳酸菌纯种培养技术降解亚硝酸盐奠定基础。【方法】在37℃培养条件下,测定含0.02%—0.16%Na NO2的MRS培养液中L.plantarum WU14 24 h的生长密度、p H及Na NO2降解量。通过PCR扩增和TA克隆得到Nir S,并克隆到乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体p RNA48中,获得重组菌L.lactis NZ9000/p RNA48-Nir S。重组菌经30 ng·m L-1 nisin诱导后,经SDS-PAGE和盐酸萘乙二胺法分析目的蛋白的表达情况及Nir S酶活。通过生物信息学软件预测分析Nir S编码的蛋白质二三级结构、跨膜结构及疏水性。【结果】L.plantarum WU14能够在Na NO2浓度小于0.12%的MRS培养基中生长并降解一部分Na NO2,在0.10%Na NO2培养液中发酵24 h后降解量达到最大,为56.34μg·m L-1,Nir S酶活达2 347.5 U·m L-1。Nir S编码的蛋白质是一种以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构的亲水蛋白。Nir S可在L.lactis NZ9000中高效表达,该重组菌能够在Na NO2浓度低于0.10%的GM17培养基中生长并降解一部分Na NO2,在含0.04%Na NO2的培养液中亚硝酸盐降解量达到最大,为22.21 mg·m L-1,Nir S酶活为925.41 U·m L-1。【结论】L.plantarum WU14的Nir S能够降解高浓度的亚硝酸盐,并且经食品级异源表达的Nir S具有较高的酶活力。本研究为探索研究亚硝酸盐降解的机理,建立发酵食品中亚硝酸盐降解的可控发酵体系提供了参考。

高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14的筛选与鉴定

D-塔格糖是一种天然低热量甜味剂。L-阿拉伯糖异构酶(L-AI)是生物法异构化D-半乳糖为D-塔格糖的关键酶。本研究从腌菜和泡菜中分离出一批乳酸菌,经薄层色谱法初筛和改良半胱氨酸咔唑法复筛,获得一株高产D-塔格糖的乳酸菌,其发酵粗酶液中L-阿拉伯糖异构酶酶活达13.95 U/m L,经16S r DNA序列比对及生化特征分析,该菌被鉴定并命名为Lactobacillus plantarum WU14。研究结果可为生物转化D-塔格糖达到工业化生产奠定基础。

The Study of Food-Grade Induced Expression and Enzymatic Properties of L-Arabinose Isomerase from Lactobacillus plantarum WU14 with High D-Tagatose Yield

L-arabinose isomerase (L-AI) is the key enzyme for D-galactose isomerization of D-tagatose by biological method. In this research, Lactobacillus plantarum WU14 with high D-tagatose yield was identified as Lactobacillus plantarum was isolated from the number of lactic acid bacteria from pickled vegetables. The crude L-arabinose isomerase activity of Lactobacillus plantarum WU14 with high D-tagatose yield was 13.95 U/mL under the optimal temperature 60&degC, pH 7.17 and substrate concentration 0.8 mol/L, and the conversion rate of 56.12% could be gained after 28 hours. Protein structure and specific of L-Arabinose Isomerase of Lactobacillus plantarum WU14 were researched. The results showed that L-arabinose isomerase is mainly composed of alpha helix and random coil. Then the recombinant L-AI gene was inserted into the food-grade expression vector pRNA48 and expressed in L. lactis NZ9000 successfully. The target protein expression reached the maximum amount when the induced concentration of nisin reaches 30 ng/mL after 12 h. And the crude enzyme activity of recombinant bacteria reached 6.21 U/mL under 60&degC. Otherwise the optimal conversion rate recombinant of L. lactis NZ9000/pRNA48-L-AI can reach 39.21% under the temperature of 50&degC, pH 7.17 and D-galactose concentration was 0.6 mol/L.

植物乳杆菌WU146-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白表达及生物信息学分析

植物乳杆菌是一类兼性异养,兼性厌氧的同型发酵乳酸菌,其在改善食品风味和发酵特性等方面发挥着重要作用,而这种功能特征与其具有糖苷酶活性密切相关。为了挖掘植物乳杆菌糖苷酶的应用价值,以植物乳杆菌WU14为研究对象,利用聚合酶链式反应(PCR)技术成功克隆了8个WU14的糖苷水解酶,生物信息学分析表明均为糖苷水解酶1家族(GH1)的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因。鉴于植物乳杆菌中该类糖苷酶鲜有报道,采用原核异源表达展开研究。序列分析表明8个酶蛋白氨基酸序列具有GH1家族的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶典型的2个保守催化位点,序列一致性在32%~74%之间。经SDS-PAGE,8个蛋白均在大肠杆菌中表达,其中BglAW14、BglCW14、BglFW14为部分可溶性表达,其余为蛋白表达,形成包涵体。生物信息学分析显示:8个基因的编码蛋白都无信号肽和跨膜结构,疏水性较强。由亚细胞定位预测可知,除BglEW14主要存在于分泌结构内和BglHW14主要存在于细胞膜外,其余6个基因都存于细胞质内。对8个6-磷酸-β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达及生物学序列分析,为进一步探究植物乳杆菌来源的6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的分子机理研究奠定了基础。

高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14的L-阿拉伯糖异构酶发酵培养基优化

D-塔格糖(D-tagatose)是一种新型甜味剂,具有降低血糖、改善肠道菌群等功能,被广泛用于食品及药品等领域。植物乳杆菌WU14(Lactobacillus plantarum WU14)可通过L-阿拉伯糖异构酶转化D-塔格糖,为提高其转化能力,以植物乳杆菌WU14的生物量及L-阿拉伯糖异构酶酶活为指标,通过单因素实验与响应面实验对高产D-塔格糖植物乳杆菌WU14发酵培养基及培养条件进行优化。结果表明,发酵培养基组成为(g/L):葡萄糖4.35g、L-阿拉伯糖2.71g、酵母浸粉17.6g、大豆蛋白胨17.6g、无水乙酸钠10g、MgSO4·7H2O0.4g、MnSO4·2H2O0.05g、K2HPO40.4g;发酵条件为:发酵初始pH值6.24、发酵温度28.6℃、接种量2%、发酵20h,在此条件下,植物乳杆菌WU14的菌体量比优化前提高了近48%,L-阿拉伯糖异构酶酶活达42.23U/mL,D-塔格糖的转化率达到69.6%。培养基的优化显著提高植物乳杆菌WU14的菌体量及L-阿拉伯糖异构酶活力,为D-塔格糖进一步工业化发酵生产提供理论基础。