E3蛋白泛素连接酶WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用

目的 探讨E3蛋白泛素连接酶WWP1调控TLR4介导的炎症性肠病炎性聚集中的作用及机制。方法 构建髓系细胞中特异性敲除E3蛋白泛素连接酶WWP1基因的小鼠,检测WPP1基因是否被敲除,随后进行分组,分为WWP敲除组(WWP1^(+/+))和WWP未敲除组(WWP1-/-),两组小鼠再分别喂养菊聚糖硫酸钠(DSS)建立炎症性肠病模型(DSS组)和喂养生理盐水(无菌水组),每组小鼠共10只,喂养7 d,每天检测小鼠结肠炎的临床症状,结束后处死小鼠,测量结肠长度,评估小鼠结肠炎损伤情况,Elisa检测小鼠结肠黏膜组织炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α水平,采用RT-qPCR和Western blot检测TLR4表达水平。同时使用基因沉默方法敲除RAW 264.7细胞的WWP1基因,使用LPS刺激构建结肠炎症情况下的巨噬细胞环境,检测WWP1+组与WWP1-组细胞中IL-6、IL-10、TNF-α和TLR4、WWP1表达水平。结果 WWP1^(+/+)组和RAW264.7细胞沉默组中WWP1-mRNA表达均明显下调,提示成功敲除WWP1基因。DSS组WWP1-/-小鼠体质量减轻程度明显大于DSS组WWP1^(+/+)小鼠,DSS组WWP1-/-小鼠的DAI值明显大于DSS组WWP1^(+/+)小鼠,DSS组WWP1^(+/+)小鼠结肠长度明显长于DSS组WWP1-/-小鼠;与WWP1-/-相比,WWP1^(+/+)的小鼠组织病理损伤程度更轻,结肠炎的症状更轻,同时小鼠IL-6、TNF-α表达水平明显更低,IL-10表达水平明显更高,炎症损伤程度更轻,RT-qPCR和Western blot检测结肠组织和细胞中TLR4的表达也显示,与WWP1-/-相比,WWP1^(+/+)的小鼠TLR4表达水平明显更低,在细胞株中,WWP1+组TLR4表达水平明显更低(P<0.05)。结论 E3蛋白泛素连接酶WWP1可以对炎症性肠病中炎性聚集起到保护作用,这种保护作用的发挥可能是通过TLR4通路实现的。

E3泛素连接酶WWP2通过蛋白酶体途径调控p21的稳定性

目的 探讨含WW结构域的E3泛素蛋白连接酶2 (WWP2)调控p21稳定性的潜在作用机制。方法 通过免疫共沉淀及Western blotting检测HEK 293T细胞中WWP2与p21的结合情况。用蛋白酶体抑制剂(MG132)和放线菌酮(CHX)处理过表达或敲减WWP2 HEK 293T细胞0、4、8 h,通过Western blotting检测p21的表达情况。结果 WWP2与p21间存在结合。过表达WWP2的293T细胞中,p21的表达水平明显降低,且随WWP2表达量增加逐渐降低。敲减WWP2的293T细胞中,p21表达水平增加。随着CHX作用时间延长,对照组和实验组的p21表达水平均逐渐下降。过表达组p21半衰期较对照组缩短;敲减组p21半衰期较对照组延长。随着MG132作用时间延长,对照组和实验组p21表达水平均逐渐上升。空载组较过表达组、敲减组较对照组p21积累均更显著。结论 E3泛素连接酶WWP2可与p21结合,并通过蛋白酶体途径降解p21。

E3泛素连接酶1对SOX2蛋白稳定性的影响

目的探讨WW结构域的E3泛素蛋白连接酶1(WWP1)和E3泛素蛋白连接酶2(WWP2)对3种转录因子[八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y-box蛋白2(SOX2)和NANOG蛋白]水平的影响。方法通过质粒转染,在HEK 293FT细胞中分别共表达OCT4、SOX2、NANOG和WWP1或WWP2。通过免疫印迹法检测WWP1或WWP2过表达对OCT4、SOX2、NANOG蛋白水平的影响。通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验分析WWP1与SOX2蛋白间的相互作用;运用体外蛋白质泛素化修饰实验证明WWP1是否为SOX2的特异E3泛素连接酶。结果在WWP1与OCT4、WWP1与SOX2及WWP2与OCT4共表达体系中,WWP1或WWP2均呈剂量依赖性地下调对应的共表达蛋白OCT4或SOX2水平,且以WWP1与SOX2共表达体系中SOX2蛋白的表达下调最为明显。在其他共表达体系中,WWP1或WWP2对对应的共表达蛋白均无明显的下调作用。溶酶体抑制剂氯喹可部分阻止SOX2蛋白水平的降低。放线菌酮(CHX)处理24 h后,WWP1与SOX2共表达体系中的SOX2蛋白水平的下降速度快于单独过表达SOX2(P<0.05)。WWP1可以通过与SOX2蛋白的直接相互作用催化SOX2蛋白的泛素化修饰。结论WWP1是SOX2蛋白新的E3泛素连接酶,可促进SOX2蛋白经泛素-溶酶体途径降解,进而下调SOX2蛋白的表达。

射血分数保留心力衰竭患者血清WWP1和NLRP3的表达水平及其临床价值研究

目的 探讨WW结构域E3泛素蛋白连接酶1(WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1,WWP1)和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)在射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)患者血清中的表达水平及临床意义。方法选取华北医疗健康集团峰峰总医院2021年1月~2022年9月收治的153例HFpEF患者为观察组,并根据患者纽约心脏病协会(New York Heart Association,NYHA)心功能分级分为心功能分级Ⅰ~Ⅱ级组(n=64)和心功能分级Ⅲ~Ⅳ级组(n=89),另选取同期体检健康的148例志愿者为对照组。血清WWP1,NLRP3水平与患者心功能指标的相关性采用Pearson分析;受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析血清WWP1和NLRP3水平对HFpEF患者心衰严重程度的诊断价值。结果 与对照组比较,观察组血清WWP1(1.68±0.35 vs 1.04±0.19)和NLRP3(6.72±1.26 ng/ml vs 4.57±0.84 ng/ml)表达水平明显升高,差异具有统计学意义(t=19.623,17.359,均P <0.05);与心功能分级Ⅰ~Ⅱ级组比较,心功能分级Ⅲ~Ⅳ级组血清WWP1(1.87±0.39 vs 1.42±0.32)和NLRP3(7.53±1.40 ng/ml vs 5.59±1.18 ng/ml)表达水平明显升高,差异具有统计学意义(t=7.744,9.017,均P<0.05);心功能分级Ⅰ~Ⅱ级组与心功能分级Ⅲ~Ⅳ级组心率、左心房内径(left atrial diameter,LAD)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室舒张末期后壁厚度(left ventricular end-diastolic posterior wall thickness,LVPWT)、左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、二尖瓣舒张早期流速峰值(peak mitral early diastolic velocity,E)/舒张晚期流速峰值(peak late diastolic velocity,A)以及心房颤动发生率比较差异均具有统计学意义(t/χ^(2)=2.757~7.069,均P <0.05);HFpEF患者血清WWP1水平与LAD,LVEDD,LVPWT呈正相关(r=0.547,0.471,0.536,均P <0.05),与LVEF和E/A呈负相关(r=-0.485,-0.417,均P <0.05);血清NLRP3水平与LAD,LVEDD,LVPWT呈正相关(r=0.534,0.494,0.520,均P <0.05),与LVEF和E/A呈负相关(r=-0.462,-0.523,均P <0.05)。ROC结果显示,血清WWP1和NLRP3水平单独诊断HFpEF患者心衰严重程度的曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.825和0.855,两者联合诊断的AUC(0.924)显著大于血清WWP1和NLRP3水平单独诊断的AUC(Z=3.600,P<0.001;Z=3.053,P=0.002)。结论 血清WWP1和NLRP3水平在HFpEF患者中明显升高,且与患者心功能密切相关,血清WWP1和NLRP3对HFpEF患者心衰严重程度具有一定的诊断价值。

三结构域蛋白21在肝细胞癌发生发展中的作用研究进展

肝细胞癌(HCC)是原发性肝癌的最主要病理类型,其发病率与病死率高,疾病负担大。同时HCC风险因素众多,发病机制复杂,至今仍未得到清晰阐述。三结构域蛋白21(TRIM21)是一类含有高度保守结构域蛋白家族中的一员,具有E3泛素连接酶活性,参与蛋白质的泛素化修饰并致其被降解。而TRIM21在HCC中发挥作用则主要基于TRIM21的泛素化修饰功能。TRIM21在HCC组织细胞中的表达水平存在差异,并与HCC患者的疾病分期、分化程度、预后等有关。现就TRIM21在HCC中的作用研究进展作一综述。

HECTD1调控PI3K/AKT信号通路对低氧诱导的脑微血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨低氧应激下HECT结构域E3泛素连接酶1(HECTD1)对脑微血管内皮细胞(BMECs)的影响及其功能机制。方法BMECs细胞在1%O_(2)的条件下培养以诱导低氧刺激。使用多种细胞生物学功能实验测定来评估BMECs中低氧诱导的损伤。乳酸脱氢酶(LDH)、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(T-SOD)水平的检测以评估低氧诱导的氧化应激水平。Western blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。结果在常氧条件下,过表达HECTD1可以提高BMECs的细胞活力。在低氧条件下,过表达HECTD1显著减轻了低氧诱导的细胞活力抑制作用。此外过表达HECTD1降低了低氧诱导的BMECs细胞凋亡和氧化应激。结论HECTD1通过阻断PI3K/AKT信号通路来保护BMECs免受低氧应激诱导的损伤,这表明HECTD1在低氧相关的脑疾病中具有治疗价值。

川续断皂苷B抑制线粒体E3泛素连接酶1减轻缺血性中风大鼠脑损伤

目的探讨川续断皂苷B对缺血性脑卒中的作用及机制。方法SD大鼠和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞分别给予左脑缺血2 h、再灌注24 h和低氧8 h、复氧24 h的处理,在动物水平和离体水平建立缺血性脑卒中模型并给予不同剂量的川续断皂苷B。通过神经功能学评分、TTC染色、TUNEL染色检测大鼠脑损伤以及运用MTS法、LDH细胞毒性释放实验、流式细胞术等手段检测PC12细胞损伤,并运用Western印迹法对相关蛋白水平进行检测。运用MOE分子对接软件对川续断皂苷B和线粒体E3泛素连接酶1(Mul1)进行分子相互作用预测。结果与假手术组相比,模型组大鼠发生了严重脑损伤(神经功能学评分升高、脑梗死灶出现、TUNEL阳性细胞增多,胱天蛋白酶3活性增强、ATP产量减少),同时Mul1和动力相关蛋白1(Drp1)水平升高,mitofusin2(Mfn2)蛋白水平降低。川续断皂苷B能够减弱脑损伤并逆转Mul1,Drp1和Mfn2的蛋白水平改变。离体水平结果一致,与对照组相比,低氧处理的PC12细胞出现了细胞损伤(细胞PI阳性率从5%左右增加至35%左右、胱天蛋白酶3活性增强、LDH释放率增加)和线粒体功能下降(线粒体膜电位ΔΨm和ATP产量下降,ROS产量和线粒体分裂增加),同时Mul1和Drp1表达上调,Mfn2蛋白水平降低,以上现象能被川续断皂苷B抑制。MOE分子对接结果显示,川续断皂苷B可能和Mul1294位Asp、303位和320位Val和318位Gly存在相互作用。结论川续断皂苷B能够通过抑制Mul1改善线粒体功能保护大鼠脑组织免于缺血性损伤。

泛素连接酶SMURF1催化ADAR1的多聚泛素化修饰

既往研究发现,SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMAD specific E3 ubiquitin protein ligase 1,SMURF1)通过其E3泛素连接酶活性介导自噬进程,然而SMURF1的泛素化底物蛋白质仍有待进一步挖掘。本文利用免疫共沉淀(Co-IP)联合蛋白质谱分析捕获并鉴定THP-1细胞中SMURF1的相互作用蛋白质集合物,发现在THP-1细胞中SMURF1可与222种蛋白质物理性结合,RNA腺苷脱氨酶1(adenosine deaminase acting on RNA 1,ADAR1)具有较高的肽段结合分数。构建SMURF1过表达载体并转染到HEK-293T细胞中,Co-IP和Western印迹检测验证外源性SMURF1与内源性ADAR1存在相互作用。qRT-PCR和Western印迹检测结果显示,在HEK-293T细胞中过表达SMURF1后ADAR 1 mRNA水平差异无统计学意义、蛋白质水平明显降低(P<0.05)。用放线菌酮(CHX)分别处理正常和过表达SMURF1的HEK-293T细胞,Western印迹检测显示,过表达SMURF1后ADAR1的半衰期缩短(P<0.05)。进一步在HEK-293T细胞中共转染泛素(Ub)过表达载体和SMURF1过表达载体,通过Co-IP和Western印迹检测结果证实,过表达SMURF1后ADAR1的多聚泛素化水平显著增加(P<0.05)。在蛋白酶体抑制剂(MG132)作用后,Western印迹检测结果表明,蛋白酶体降解途径受抑制后SMURF1对ADAR1的负调控作用减弱(P<0.05)。本研究表明,SMURF1可以与ADAR1相互作用,催化ADAR1的多聚泛素化修饰并介导其蛋白酶体途径降解,为探索SMURF1通过影响ADAR1蛋白质稳定性而具备的多种生物学功能提供理论基础。

急性脑梗死病人血清circ_HECTD1表达与病情严重程度的关系

目的:探讨急性脑梗死(ACI)病人血清环状RNA HECT结构域E3泛素蛋白连接酶1(circ_HECTD1)表达情况,分析circ_HECTD1与病情严重程度的关系。方法:选取2020年9月—2021年11月开滦总医院收治的ACI病人122例为ACI组,另选同期于本院体检的健康志愿者122名为对照组。收集基本临床资料,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测血清circ_HECTD1水平。Pearson法分析ACI病人血清circ_HECTD1水平与临床资料及美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分的相关性;多因素Logistic回归分析ACI严重程度的影响因素。结果:ACI组高血压比例、空腹血糖、白介素(IL)-6、IL-1β、C反应蛋白(CRP)、白细胞计数(WBC)及circ_HECTD1水平均高于对照组(P<0.05);中度组、重度组年龄、IL-6、IL-1β、空腹血糖、CRP、WBC及circ_HECTD1水平均高于轻度组(P<0.05);多因素Logistic回归分析显示,糖尿病、IL-6、IL-1β及circ_HECTD1均是ACI病人中重度神经缺损的危险因素(P<0.05);血清circ_HECTD1水平与空腹血糖、WBC、IL-6、IL-1β、CRP及NIHSS评分均呈正相关(P<0.05)。结论:ACI病人血清circ_HECTD1水平升高,且随病情加重而增加,是中重度神经缺损的危险因素。

E3泛素连接酶COP-1在脂多糖致小鼠急性肺损伤中的意义

目的 分析E3泛素连接酶组成型光形态发生蛋白1(constitutive photomorphogenetic protein 1, COP-1)全身敲除后的杂合子小鼠在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)致急性肺损伤(acute lung injury, ALI)中的表现及作用机制。方法 选择48只雄性C57小鼠,随机分为4组:已敲除COP-1:COP-1+/--PBS(KOPBS组)、COP-1+/--LPS(KOLPS组);未敲除COP-1:WT-PBS(WTPBS组)、WT-LPS(WTLPS组),每组12只。KOLPS组、WTLPS组给予LPS 10 mg/kg气管内滴注进行ALI造模,KOPBS组、WTPBS组用同等体积的PBS处理相同时间。造模24 h后,取肺组织,HE染色观察肺组织形态学改变,测定湿/干重比值(W/D),ELISA法测定肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)和肺组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)、肺组织中髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活力。结果 形态学观察表明KOLPS组肺组织和WTLPS组、KOPBS组肺组织和WTPBS组比较炎性细胞浸润、充血、水肿显著。KOPBS组和WTPBS组,KOLPS组和WTLPS组比较,炎症因子水平以及肺组织中MPO活力和肺W/D比值升高(P<0.05)。结论 敲除小鼠E3泛素连接酶COP-1加重LPS致ALI,探讨COP-1在肺炎中治疗作用,具有临床意义。

含HECT和锚蛋白结构域的E3泛素化连接酶-1在肝癌中表达的意义及其对肝癌细胞增殖、侵袭能力的影响

目的 观察含HECT和锚蛋白结构域的E3泛素化连接酶-1（HACE1）在肝癌中的表达水平与预后的关系及其对肝癌细胞增殖、侵袭能力的影响.方法 免疫组织化学检测100例肝癌和癌旁组织HACE1的表达,Kaplan-Meier和Log-rank分析HACE1表达水平与患者预后的关系;利用脂质体质粒转染建立Huh7-HACE1细胞株,通过细胞计数试剂盒（CCK-8）观察HACE1过表达对Huh7细胞增殖的影响,应用Transwell检测HACE1过表达对Huh7细胞侵袭能力的影响.结果 肝癌组织中HACE1表达低于和高于癌旁组织的患者分别为68和32例,两者5年生存率对比（70.8％比90.3％）和5年复发率对比（59.7％比30.6％）差异有统计学意义（P＜0.01）.细胞增殖实验结果显示4d后Huh7-HACE1组吸光度（A）值显著低于对照组（P＜0.05）;Transwell结果显示Huh7-HACE1组侵袭能力显著低于对照组（P＜0.05）.结论 HACE1基因在肝癌组织表达水平显著低于癌旁组织,其表达水平与肝癌预后相关;过表达HACE1可抑制肝癌Huh7细胞的增殖和侵袭能力.该基因可能在肝细胞肝癌的发生发展中起重要作用.

Circ_HECTD1调节miR-135a-5p/TP53INP1轴对OGD/R诱导的海马神经元损伤的影响

目的通过进行体外氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导海马神经元损伤,观察环状RNA含HECT结构域的E3泛素连接酶1(Circ_HECTD1)对HT22细胞增殖、凋亡的影响以及对微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)/肿瘤蛋白53诱导型核蛋白1(TP53INP1)轴的调控机制。方法常规培养HT22细胞,将细胞分为Con组、OGD/R组、si-NC组、si-Circ_HECTD1组、miR-NC组、miR-135a-5p组、si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC组、si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p组。qRT-PCR法检测Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表达;MTT检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验验证Circ_HECTD1与miR-135a-5p、miR-135a-5p与TP53INP1的靶向关系;Western blot法检测Bax、Bcl-2、TP53INP1蛋白表达。结果OGD/R诱导后HT22细胞中Circ_HECTD1与TP53INP1表达上调,miR-135a-5p表达下调,细胞存活率和Bcl-2蛋白表达显著下降,凋亡率和Bax蛋白表达显著升高(均P<0.05)。沉默Circ_HECTD1表达能够显著上调OGD/R诱导的HT22细胞中miR-135a-5p表达,下调TP53INP1表达,提高细胞存活率和Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡率和Bax蛋白表达(均P<0.05)。Circ_HECTD1与miR-135a-5p、miR-135a-5p与TP53INP1之间均存在靶向关系。过表达miR-135a-5p能够显著下调TP53INP1表达,提高细胞存活率、Bcl-2蛋白表达,降低细胞凋亡率、Bax蛋白表达(均P<0.05)。而抑制miR-135a-5p表达能够部分逆转沉默Circ_HECTD1对HT22细胞损伤的保护作用。结论沉默Circ_HECTD1可通过调节miR-135a-5p/TP53INP1轴,促进细胞存活,抑制细胞凋亡,保护OGD/R诱导的海马神经元损伤。

E3蛋白泛素连接酶WWP1在乳腺癌中的表达及意义

目的探讨E3蛋白泛素连接酶WWP1在乳腺浸润性癌中的表达及意义。方法采用免疫组织化学法检测WWP1在97例乳腺浸润性癌和15例正常乳腺中的表达情况。结果 WWP1在乳腺浸润性癌细胞中表达,阳性率为41.2%(40/97);而在正常乳腺中不表达。结论 WWP1在乳腺浸润性癌中过表达,可能与乳腺癌的发生发展有关。

HACE1在恶性肿瘤中的研究进展

含HECT域和瞄蛋白重复序列的E3泛素蛋白连接酶1(HACE1)蛋白属于HECT家族的重要成员之一,其不仅具有保护心脏、抗氧化应激及调节细胞动力学等生物学功能,而且在多种恶性肿瘤(乳腺癌、肝癌、胃癌等)中发挥肿瘤抑制因子的作用。其作用机制是通过靶向活化形式的Rac家族进行蛋白酶体降解及泛素化视神经蛋白,激活细胞自噬,进而发挥抗肿瘤作用。HACE1与多种肿瘤的发生、进展、侵袭及预后密切相关,其有望成为恶性肿瘤诊断和预后的预测标志物及肿瘤治疗的新靶点。

含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1降解依托泊苷诱导蛋白24并促进肝癌细胞增殖

目的筛选含有WW结构域的泛素蛋白连接酶1(WWP1)相互作用蛋白,探讨WWP1和依托泊苷诱导蛋白24(EI24)对肝癌细胞增殖的影响。方法利用酵母双杂交的方法筛选与WWP1相互作用的蛋白,并利用免疫共沉淀来进行相互作用验证。通过体内泛素化实验验证泛素连接酶WWP1与EI24酶和底物的关系。以慢病毒感染的方法建立WWP1和EI24稳定过表达或敲低表达的肝癌细胞系。通过细胞增殖实验、平板克隆实验和裸鼠成瘤实验检测WWP1和EI24对肝癌细胞增殖的影响。结果WWP1可以与底物EI24相互作用,并能够在体内将EI24泛素化降解。成功构建稳定过表达或敲低表达的WWP1和EI24的肝癌细胞系HepG2。在HepG2细胞中,过表达WWP1可以降低内源EI24的蛋白水平,而敲低WWP1可以使EI24蛋白水平增加。细胞计数盒8(CCK-8)法检测结果表明,在36 h时,WWP1过表达组和shWWP1组细胞的相对增殖活性分别为(347.00±8.15)%和(187.08±4.86)%,与对照组(270.33±15.01)%比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。在36 h时,EI24过表达组和shEI24组细胞的增殖活性分别为(183.75±8.11)%和(317.33±9.60)%,与对照组(270.33±15.01)%比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。克隆形成实验结果显示,对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的克隆形成数分别为(52±7)个/视野、(76±4)个/视野和(19±3)个/视野,WWP1过表达组细胞克隆形成明显增多(P<0.05),而敲低WWP1后细胞克隆形成较对照组减少(P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的克隆形成数分别为(38±4)个/视野、(10±3)个/视野和(69±7)个/视野。与对照组比较,过表达EI24使细胞克隆形成明显减少(P<0.05),敲低EI24的表达使细胞克隆形成明显增多(P<0.05)。裸鼠体内实验结果显示,经过4周同等条件喂养后,对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1400.00±43.71)mm3、(2636.67±290.45)mm3和(642.17±36.00)mm3,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、WWP1过表达组和shWWP1组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.23±0.08)g、(2.05±0.17)g和(0.88±0.09)g,差异均有统计学意义(P<0.05)。WWP1过表达组细胞成瘤能力明显增强,shWWP1组成瘤能力明显减弱。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤体积分别为(1245.17±93.10)mm3、(662.17±60.88)mm3和(1986.67±226.75)mm3,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、EI24过表达组和shEI24组的裸鼠移植肿瘤重量分别为(1.15±0.04)g、(0.85±0.02)g和(1.73±0.05)g,差异有统计学意义(P<0.05)。EI24过表达组细胞成瘤能力明显减弱,shEI24组成瘤能力明显增强。结论WWP1可以靶向底物EI24进行泛素化降解,并促进肝癌细胞的增殖。

上皮性卵巢癌组织WW结构域E3泛连接酶1表达及意义

目的观察WW结构域E3泛连接酶1(WW domain-containing E3 ubiquitin protein ligase 1, WWP1)在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与上皮性卵巢癌患者临床病理特征的关系,探讨其在上皮性卵巢癌发生、发展中的作用。方法上皮性卵巢癌患者69例,均行卵巢癌肿瘤细胞减灭术,术后紫杉醇+卡铂方案化疗6个周期。取手术切除肿瘤组织及癌旁组织,采用实时荧光定量PCR法检测WWP1 mRNA相对表达量。根据术后FIGO分期,将69例患者分为早期组(Ⅰ~Ⅱ期)21例,晚期组(Ⅲ~Ⅳ期)48例;依据肿瘤组织WWP1 mRNA相对表达量中位数,将69例患者分为WWP1高表达组(WWP1 mRNA相对表达量≥0.025)36例,WWP1低表达组(WWP1 mRNA相对表达量<0.025)33例。比较早期组、晚期组和癌旁组织WWP1 mRNA相对表达量;比较WWP1高、低表达组年龄、病理类型、FIGO分期等临床病理特征;随访观察WWP1高、低表达组无进展生存期。结果早期组、晚期组WWP1 mRNA相对表达量[0.031(0.019, 0.044)、0.041(0.021, 0.054)]均高于癌旁组织[0.025(0.015, 0.034)](P<0.05),晚期组高于早期组(P<0.05)。WWP1低表达组FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期比率(54.5%)高于WWP1高表达组(27.8%)(P<0.05);WWP1低表达组与高表达组年龄、病理类型、肿瘤分化程度、糖链抗原125水平及淋巴结转移率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。WWP1低表达组中位无进展生存期(18个月)长于WWP1高表达组(14个月)(P<0.05)。结论 WWP1在上皮性卵巢癌肿瘤组织表达升高,WWP1高表达提示FIGO分期晚、预后差。

HECW2基因与肿瘤的研究进展

含HECT,C2和WW域E3泛素蛋白连接酶2(HECW2)基因通过调节蛋白质的泛素化和降解过程参与细胞周期调控、信号转导以及细胞死亡等关键的生物学过程。既往有关HECW2基因的研究多聚焦于神经发育障碍与智力障碍等非肿瘤方面,而关于其在肿瘤发生发展中的作用机制的报道较少。近年研究认为HECW2基因在多种肿瘤类型中异常表达,并在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程中发挥重要功能,可影响肿瘤的生物学行为,这为后续探索肿瘤的分子机制提供了新的视角,为肿瘤的个性化靶向治疗奠定了前期基础。

黑色素瘤相关抗原MAGEA1的定位及其相互作用蛋白质的鉴定

黑色素瘤相关抗原家族A1蛋白(melanoma associated antigen family A1,MAGEA1)在生殖细胞和多种组织学来源的肿瘤中有表达,但其作用机制尚不清楚。本研究通过构建带Flag和GFP标签的MAGEA1真核表达重组质粒,将其转染至HeLa、HEK293T细胞内。利用Western印迹、免疫细胞荧光法、免疫共沉淀、细胞核蛋白质与细胞质蛋白质分离和线粒体提取等技术,检测其在细胞内的表达与定位以及与其他蛋白质的相互作用情况。免疫细胞化学和蛋白质印迹结果显示,过表达的MAGEA1主要定位于细胞质,并部分与线粒体共定位。通过免疫共沉淀验证了MAGEA1与TRIM31、SNW1、HDAC1之间存在相互作用,并且发现MAGEA1可能主要与位于细胞质中的HDAC1相互作用。以上研究表明,MAGEA1可能参与不同的细胞内调节途径,部分与线粒体共定位;与TRIM31、SNW1、HDAC1相互作用,且可能主要与位于细胞质中的HDAC1蛋白相互作用,推测其可能参与到蛋白质泛素化和Notch信号通路。本研究的结果为后续深入研究MAGEA1的作用机制奠定了实验基础。

啤酒酵母Ubr1野生型和缺失型菌株的比较蛋白组学分析

目的寻找并验证Ubr1泛素化底物蛋白大规模筛选方法的可行性。方法通过对啤酒酵母RJD347(Ubr1野生型)和AVY26(Ubr1缺失型)的差异蛋白质组学比较,分析酵母中可能存在的Ubr1直接或间接作用的底物蛋白。进一步通过外源表达实验验证差异蛋白与Ubr1之间的相关性。结果组学研究得到249个差异表达蛋白,其中145个蛋白在AVY26(Ubr1缺失型)中表达上调。选取其中40个并外源表达验证5个差异蛋白MLC2、SCD6、AR G1、HO G1及R TF1与Ubr1具有相关性,受泛素连接酶Ubr1的泛素化调控。结论建立Ubr1泛素化底物候选蛋白库,同时验证出5个潜在Ubr1泛素化底物蛋白。

受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)调控人结肠癌HT-29细胞程序性坏死的分子机制

目的研究受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)在人结肠HT-29细胞程序性坏死过程中的作用,并探讨E3泛素连接酶三重结构域包含蛋白16(tripartite domain containing protein 16,Trim16)对其作用的潜在调控机制。方法用肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)建立HT-29细胞的程序性坏死模型,采用Annexin V-FITC/PI双染色法检测其对凋亡、坏死细胞数目的影响。分别用Western blot和qRT-PCR检测RIPK1在细胞程序性坏死中的表达。构建稳定表达Flag标记的RIPK1的HT-29细胞株,采用Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现与RIPK1有相互作用的新蛋白。应用NiNTA pulldown试验检测筛选出的E3泛素连接酶对RIPK1泛素化的调控。结果 TNFα能够成功诱导HT-29细胞程序性坏死。HT-29细胞在TNFα和半胱天蛋白酶抑制剂z-VAD处理后,表现出RIPK1、RIPK3、混合系列蛋白激酶样结构域(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)表达水平显著增加,并伴随着炎性因子白介素1α(IL1α)和白介素6(IL6)水平明显升高。Flag标记的pulldown试验结合质谱检测发现一个与RIPK1有相互作用的E3泛素连接酶Trim16,体外实验表明Trim16可以增强RIPK1的泛素化程度,其可能调节RIPK1在程序性坏死过程中的作用。结论 RIPK1在TNFα和z-VAD诱导人结肠癌HT-29细胞的程序性坏死过程中起重要作用,E3泛素连接酶Trim16对此过程可能有重要调控作用。