实验用近交系小型猪WZSP表皮干细胞建系的初步研究

目的将五指山猪(Wuzhi Shan Pigs,WZSP)表皮干细胞传至15代以上,初步建立实验用近交系小型猪WZSP表皮干细胞系。方法采集WZSP耳组织,通过中性蛋白酶消化获得表皮细胞,再通过0.25%胰酶+0.02%EDTA消化制成单个表皮细胞悬液,接种在Ⅳ型胶原包被的培养瓶内,采用无血清条件培养基培养,0.25%胰酶消化传代。对所培养表皮干细胞进行AKP染色鉴定。结果表皮干细胞能够快速粘附在Ⅳ型胶原上,呈克隆状生长,已传至15代以上,传代间隔为7 d左右;取第5代细胞进行AKP染色呈阳性。结论在本实验条件下,建立ESCs细胞系是可能的,经鉴定,所培养细胞具有干细胞基本特性。

五指山猪的肉质分析研究

本文从不同的方面对五指山小型猪 ( WZSP)的肉质进行了比较分析。研究表明 :WZSP具有皮薄、膘少、背肌厚、氨基酸组成丰富、肌内脂肪含量少的特点 ,为 WZSP的肉质的开发利用提供了理论依据。

五指山猪近交系群体中DRA和DRB基因的SSCP检测

为确定五指山猪(WZSP)近交系群体SLA!ⅡDRA、DRB基因的等位基因数及其特性,利用PCR扩增SLA!ⅡDRA、DRB基因的第2外显子序列,经单链构象多态性即SSCP检测其等位基因数,选择纯合子个体的PCR产物直接测序。对所获得的序列与Genbank中所有相应的序列进行比对和聚类分析,特别是SLA!DRB!C、SLA!DRB!D、HLA!DRB*09012、HLA!DRB*1201、HLA!DRA*0101等位基因。结果表明:在WZSP近交系群体中,DRA、DRB各有2个等位基因且发现1个DRB新等位基因。DRA第2外显子有很强的保守性,而DRB基因呈现出高度的多态性,在核苷酸水平同源性为85%以上,氨基酸水平同源性为70%以上。该试验成功地检测了WZSP近交系SLA!DRA、DRB基因的等位基因及其特性,为建立WZSPSLA!DR基因抗原的分子分型及特异单倍型猪的培育研究奠定基础。

锌指核酸酶技术制备肌肉生长抑制素基因敲除的五指山小型猪成纤维细胞

敲除猪肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因可能提高猪瘦肉率,MSTN基因敲除猪也可作为相关疾病的动物模型。文章利用锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFNs)技术敲除五指山小型猪胎儿成纤维细胞MSTN基因,为制备MSTN基因敲除猪奠定基础。ZFNs质粒或编码ZFNs的mRNA均能高效敲除MSTN基因,使用ZFNs mRNA能直接得到MSTN+/-和MSTN-/-两种基因型的细胞克隆。DNA序列测定与分析发现,细胞克隆的突变类型多为ZFNs作用靶位点处不大于10 bp的碱基插入或缺失(92.18%);氨基酸预测发现,突变型MSTN基因的终止密码子常常提前出现。将MSTN基因敲除的细胞进行体细胞核移植(Somatic cell nuclear transfer,SCNT)发现,胚胎体外早期发育潜力与野生型无显著差异,表明这些细胞可用于后续MSTN基因敲除猪的制备。

五指山猪精液冷冻保存研究

试验利用液氮熏蒸法进行颗粒冻精,以1组冷冻保护液为对照,2组,3组冷冻保护液以氨基酸代替部分糖类物质,以解冻后的精子活力、活率和顶体完整性为判断标准,比较了4种冷冻保护液及不同冷冻-解冻程序对五指山猪精液冷冻的影响。结果表明:解冻后精子2组,3组的3个判断标准均显著高于1组(P<0.05);4组(2.5 mL DMSO)冷冻保护液解冻精子的活力和活率显著低于2组(2 mL甘油)和3组(1.25 mL DMSO+1 mL甘油)(P<0.05)。精清保留量为0 mL/10 mL时解冻精子的活率和活力显著低于0.5 mL/10 mL和1 mL/10 mL(P<0.05)。干解法解冻后精子活率显著高于湿解法(P<0.05)。

实验用五指山小型猪正常生理值测定

目的建立中国实验用五指山小型猪正常生理参考值。方法选用24头中国实验用五指山小型猪,雌雄各半,对其体重、体温2、0项血液学指标2、1项血清生化指标、4项心电图指标、尿常规、主要脏器重量和脏器系数进行了测定,并选用同一批动物对其血液学、血清生化、心电图等生理指标进行了为期4个月的连续测定。结果五指山小型猪部分指标如血液学的WBC、LYM%、GRAN%、PCT,血清生化指标如ALP、P、Na、Cl雌雄动物相差显著,其他指标较一致。心电图指标、体重、主要脏器系数雌雄较一致,部分生化指标如GGT等与临床人正常值较接近。动态测定结果提示各项主要指标测定结果较稳定,随着饲养时间的延长,少数血液生化指标如WBC、GOT有一定的改变,但幅度较小。结论初步建立了中国实验用五指山小型猪正常生理参考值,这些生理数据的采集为其进一步开发和应用提供了有益的参考。

内源性逆转录病毒在五指山小型猪体内存在状况的分子微生物学调查

根据猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag)基因、多聚酶(pol)基因、囊膜(env)基因和β-肌动素(β-actin)基因核酸序列设计并筛选特异性引物6对,利用PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因存在情况进行系统检测;利用半定量RT-PCR方法对五指山小型猪PERVgag、pol和env基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉7个组织中的表达情况进行系统检测与分析。结果显示,在202个被检样品中,gag、pol基因和envB基因亚型均存在,envA基因亚型仅3个样品未发现,envC基因亚型共检出34个,检出率为16.8%。所测试的7个组织均表达gag、pol和env基因序列,但envC仅在1头个体的组织中表达。各组织gag mRNA丰度以肾脏为最高,其次为肺、心、肝、脾,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织pol mRNA丰度以肾脏为最高,其次为脾、肺、肝、心,肌肉和脑组织的丰度最低。各组织envA、envB mRNA丰度信号强度分布与gag、pol信号类似,亦以肾脏为最高,脑和肌肉组织的丰度最低。各组织envC mRNA的信号强度明显低于envA、envB。以上结果表明,在五指山小型猪中存在PERV,且在各组织中的表达量有差异。

近交培育五指山小型猪GHR基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的探讨近交培育五指山猪矮小的分子机理,为五指山猪实验动物化奠定基础。方法近交系五指山猪肝脏组织提取总RNA,然后RT-PCR成功扩增出GHR基因,克隆入pGEM-Teasy载体进行测序,并与正常猪GHR基因序列进行比对;然后经SalⅠ和XbaⅠ双酶切回收后与同样经过双酶切回收的pEGFP-C1真核表达载体连接,构建五指山猪GHR基因真核表达载体。结果测序结果表明:五指山猪GHR基因编码区包括639个氨基酸;经过酶切和测序验证五指山猪GHR基因真核表达载体构建成功。结论经序列比对后发现GHR信号肽编码区发生两处氨基酸替换,可能会影响到生长激素的胞内运输;生长激素受体胞内域编码区发生多处突变,并且导致相应氨基酸发生替换,可能会影响生长激素受体的下游信号转导。五指山猪GHR基因真核表达载体的成功构建为进一步研究GHR的功能和下游信号转导奠定了基础。

五指山小型猪PPARγ2基因启动子多态性分析

目的对五指山小型猪PPARγ2基因启动子调控区域多态性进行分析。方法根据猪PPARγ2启动子调控区域2200 bp设计5对引物,对57头封闭群五指山小型猪的多态性进行检测,并用多种生物信息学软件对调控区域的启动子、转录因子结合位点、RNA二级结构、Cp G岛进行预测分析。结果筛选到9个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)位点,分别是:-1595T/C、-1534G/A、-1262C/A、-1220C/A、-1017A/G、-963A/G、-955G/A、-866A/G、-333G/A。SNPs都没有处在软件识别的启动子区域中,但-333G/A突变位于核心启动子(-656^-23 bp)区域。突变的SNP位点附近转录因子结合位点会发生改变,突变前后RNA二级结构最小自由能发生变化,其结构也发生显著变化。目标序列未找到Cp G岛。结论筛选到的五指山小型猪PPARγ2启动子调控区域SNPs可能对该基因的表达调控产生影响,为进一步研究其功能奠定基础。

实验用五指山小型猪选育

目的培育符合生物医学研究需要、标准化程度高的实验用五指山小型猪。方法常规遗传育种技术与现代遗传育种技术相结合，对现有五指山小型猪资源进一步选育和实验动物标准化研究，以建立遗传多样性丰富的封闭群和基因纯合度高的近交系。结果利用我国特有的五指山小型猪资源及其已有的保种选育成果，在保持其体小特性的前提下，在封闭群引种群遗传多样性丰富，近交选育群引种群基因纯合度高的基础上，形成实验用封闭群和两个近交选育群。结论形成的封闭群和近交选育群保持了体型矮小的特性，标准化程度提高，生理、生化、遗传等生物学特性稳定，生产繁殖性能较高，具有广泛的环境适应性，是理想的实验动物资源，可满足多种研究领域的需要，有着重要的应用价值和广阔的发展前景。

利用微卫星标记对五指山小型猪近交群的遗传分析

目的分析五指山小型猪近交群的遗传变异及近交程度。方法利用26个微卫星基因座对五指山小型猪近交群进行了遗传多样性检测，统计了各位点等位基因组成，并计算它们的平均基因纯合率、平均多态信息含量和平均杂合度。结果近交群26个基因座的共检测到180个等位基因，平均等位基因数为6．92，平均基因纯合率为56．57％，平均多态信息含量为0．6042，平均杂合度为0．4478。结论五指山小型猪近交群具有较高的纯合度，保持了一定的遗传稳定性。

海南原产地五指山猪资源保护与开发利用

五指山猪是我国著名的微型猪种,原产于海南省,具有体型小、早熟、耐近交、遗传稳定、适应性强等特点,是中国猪种多样性一个重要组成部分。文章简要介绍了对濒临灭绝的五指山猪(WZSP)进行原产地保种繁育、种质测定、试验化培育、分子遗传学等基础性研究。结果建立了以"资源保护场"为核心,与保种区相结合的动态保种模式,并把先进的方法和技术运用到五指山猪保护中,培育优质新品系以适应市场的需求。同时把五指山猪作为试验动物模型进行开发利用,已培育成为五指山猪小型猪封闭群和近交群体,并进行了试验动物模型建立的初步研究和开发利用探索。

五指山小型猪糖耐量试验及血脂分析

目的 确定五指山小型猪的正常糖耐量水平,并检测血脂,筛查糖、脂代谢异常小型猪.方法 选择未去势的五指山小型猪,禁食不禁水12h后按1.2 ml/kg体重的剂量静脉注射50％葡萄糖注射液,并分别在注糖前、注糖后10、30、60、90和120 min采血测定血糖值.同时采取空腹血清送实验室检测血糖（Glu）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等生化指标.结果 静脉注糖后血糖水平出现显著性波动,注糖后10 min内血糖水平达到峰值,随后逐渐下降,直至注糖后90 min恢复到给糖前水平.有7头小型猪的糖耐量部分血糖值超过95％置信度上线值,有12头小型猪部分相关的血清生化指标值超过95％置信度上线值.相关性分析发现Glu与TG、TC、HDL-C、LDL-C这4个指标都存在显著的相关性,多因素分析表明TG、HDL-C与Glu显著相关.结论 筛选出糖代谢或脂代谢异常,以及糖耐量减低的小型猪.

近交五指山小型猪精液冷冻保存技术的研究

用液氮熏蒸法在氟板上制作冻精颗粒,以解冻后的精子活率、活力和质膜完整性为判定指标,比较4种冷冻稀释液及不同冷冻-解冻程序对五指山小型猪精液冷冻的效果。结果表明:①Ⅳ号冷冻稀释液冷冻解冻后精子的活率(0.610±0.036)、活力(0.427±0.025)和质膜完整性(0.503±0.015)均显著高于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ号冷冻稀释液(P<0.05)。②实验中精液在4℃冰箱中平衡降温2 h的精液精子活力、质膜完整性均好于在17℃平衡3 h再放入4℃冰箱中平衡2 h的解冻效果,而且精子活率差异显著(P<0.05)。③湿解法的效果优于干解法。

应用半乳糖表型差异高效筛选α-1,3半乳糖苷转移酶基因缺失的猪成纤维细胞

【目的】筛选α-1,3半乳糖苷转移酶(α1,3galactosyl transferase,GGTA1)基因缺失的猪成纤维细胞。【方法】用同源重组载体pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO电转染GGTA1单等位基因敲除(GGTA1+/-)的五指山小型猪胎儿成纤维细胞,利用磁激活细胞分选(MACS)、MACS联合流式细胞术(FACS)、TcdA联合FACS等3种方法进行细胞筛选;对MACS筛选获得的单细胞克隆进行PCR和FACS鉴定,对MACS联合FACS、TcdA联合FACS获得的细胞集落进行PCR鉴定。【结果】经MACS筛选获得了11个细胞克隆,经鉴定2个是GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为18.2%;MACS联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定无GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为0;TcdA联合FACS筛选获得了3个细胞克隆,经鉴定均为GGTA1-/-细胞克隆,阳性率为100%。【结论】MACS法筛选和TcdA联合FACS法筛选这2种方法均可以高效筛选出GGTA1双等位基因缺失的猪成纤维细胞,可用于进一步制备供异种器官移植的基因修饰小型猪。

猪原始生殖嵴(PGCs)细胞分离、建系培养

Inbred of Wu Zhishan miniature pig(WZSP)at 5 to 8 Mouths of age,which were used as embryo donors.The total 75 fetuses was collected from 14 donors at day 25 to 29 of pregnancy(estrus=day 0),which was used for in vitro culture,clone,isolation,passage of porcine embryonic germ(PEG).The results were shown that:(1)The PGCs of fetuses between days 2729 of pregnancy(estrus=0)was easily to collect and more suitable to set up PEGs.(2)The PEGs clones with WZSP was coming out 2 days early than Shim(97),Piedrahita(98)and Mueller(99)reported previously.(3)PEG′s will be survival in vitro after thawing.

铅在五指山猪组织器官中的分布与积累研究

研究了铅在五指山猪(WZSP)组织器官中的分布与累积,及饲料铅含量与组织器官中铅含量的关系.将20头五指山猪随机分为5组,分别饲喂含铅量为0.046mg·kg-1(Ⅰ组)、6.790mg·kg-1(Ⅱ组)、17.370mg·kg-1(Ⅲ组)、53.600mg·kg-1(Ⅳ组)、154.000mg·kg-1(Ⅴ组)的饲料,持续喂养100d.屠宰后取心脏、肝脏、肾脏、肺、胃、小肠、大肠、猪耳、猪舌、猪尾、里脊肉、肋排肉、股骨骨质、股骨骨髓、肋骨和猪毛,测定其中的铅含量.结果表明,肝脏、肾脏、股骨骨质、股骨骨髓、肋骨、猪毛等组织器官的铅含量随攻毒剂量的提高而明显上升,且与饲料中的铅含量呈正相关;当饲喂铅含量低于国家标准(5mg·kg-1)时,这些组织器官内的铅含量仍有可能超标.心脏、肺、胃、大肠、里脊肉、猪舌、猪尾中的铅含量与饲料中的铅含量没有相关性,即使饲喂铅含量超过国家标准30倍以上的饲料(铅含量154.000mg·kg-1),这些组织器官的铅含量仍低于国家限量标准.骨组织、肝脏、肾脏对铅有着较强的富集能力,而猪肉、猪耳、猪舌、猪尾、猪心、猪肺等其它组织器官中的铅累积量低于限量标准.本研究旨在为制定猪肉制品,特别是可食用组织器官的铅限量标准提供理论依据,同时,为禽畜可食用组织器官的重金属风险评估提供参考.

五指山猪的肉质分析研究

本文从不同的方面对五指山小型猪(WZSP)的肉质进行了比较分析。研究表明:WZSP具有皮薄、膘少、背肌厚、氨基酸组成丰富、肌内脂肪含量少的特点,为WZSP的肉质的开发利用提供了科学依据。

转人乳铁蛋白基因大米主要营养素的体内消化率及蛋白质营养价值评价

目的对转人乳铁蛋白基因大米(hLF大米)与亲本大米(PR大米)主要营养素在体内的消化代谢及蛋白质的营养价值进行初步比较评价。方法以6头近交系五指山小型去势公猪为实验动物,进行回肠末端造瘘手术安置T型瘘管,采用交叉法分别饲喂hLF大米、PR大米,收集回肠末端消化产物分析比较两种大米主要营养素的体内消化率,采用经消化率校正的氨基酸评分法(PDCAAS)对两种大米蛋白质的营养价值进行初步评价。结果 hLF大米与PR大米在蛋白质/氨基酸、碳水化合物、脂肪、纤维素的消化率上均无显著差异。人乳铁蛋白基因的插入使hLF大米中各氨基酸的含量配比得到了一定的优化,且其PDCAAS比亲本大米提高了2.66%。结论 hLF大米与PR大米在五指山小型猪体内主要营养素的消化代谢上满足"实质等同性"的要求,PDCAAS的结果显示hLF大米中蛋白质的质量略有提高。