基于AMPK/mTOR通路介导的自噬探讨温补固肾方对糖尿病肾纤维化的影响

目的:探究温补固肾方调控AMPK/mTOR通路介导的自噬途径对糖尿病肾纤维化的保护机制。方法:雄性SPF级SD大鼠100只,除对照组20只外,均采用腹腔注射链脲佐菌素(60 mg/kg)构建糖尿病肾病模型。其中60只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、达格列净组(1.0 mg/kg)、温补固肾方低、中、高剂量组(0.92、1.84、3.68 g/kg),每组各10只。给予相应药物灌胃12周后,检测各组大鼠肾功能生化指标;HE和PAS染色观察肾组织病理形态变化;免疫组化法检测肾组织α-SMA,E-Cadherin表达;电镜观察自噬小体形成;Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR表达。剩余40只大鼠随机分为对照组、糖尿病肾病组、温补固肾方高剂量组(3.68 g/kg)、温补固肾方高剂量组+AMPK抑制剂组(20 mg/kg),每组各10只。给予相应药物12周后,检测大鼠肾功能生化指标,电镜观察肾组织病理形态,Masson染色观察肾纤维化程度,Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及AMPK/mTOR通路蛋白表达。结果:与对照组比较,糖尿病肾病组大鼠肾功能损伤严重,并伴有明显的病理损伤,肾组织α-SMA表达增加,E-Cadherin表达降低(P<0.01),自噬小体数量减少(P<0.01),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p-AMPK/AMPK比值降低,p-mTOR/mTOR比值增加(P<0.01)。与糖尿病肾病组比较,温补固肾方各剂量组大鼠肾功能及组织病理性损伤均有不同程度改善,α-SMA表达降低,E-Cadherin表达增加(P<0.05,P<0.01),自噬小体数量增加,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及p-AMPK/AMPK比值增加,p-mTOR/mTOR比值降低(P<0.05,P<0.01)。与温补固肾方高剂量组比较,AMPK抑制剂能够逆转温补固肾方糖尿病肾病大鼠的治疗作用,抑制上述相关指标变化。结论:温补固肾方能够激活AMPK/mTOR通路介导的自噬改善糖尿病大鼠肾纤维化。

基于网络药理学探究温补固肾方治疗糖尿病肾病的作用机制及实验验证

目的:基于网络药理学探讨温补固肾方(WBGSF)治疗糖尿病肾病(DN)的作用机制。方法:利用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)筛选WBGSF有效活性成分及潜在靶点,在GeneCard、OMIM和TTD数据库中寻找DN相关靶点基因,选取WBGSF靶点基因与DN相关靶点基因的共同靶点。通过Cytoscape 3.5.0软件构建“WBGSF活性成分-潜在靶点-DN”网络图。运用STRING数据库构建蛋白质互作(PPI)网络图。对潜在靶点基因进行基因本体(GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析。SD大鼠随机分为对照组(Control)、糖尿病肾病组(DN)和WBGSF低、中、高剂量组。采用链脲佐菌素腹腔注射构建DN模型大鼠。模型构建成功后WBGSF各剂量组大鼠分别给予0.92、1.84、3.68g/kgWBGSF灌胃,每日1次,连续给药12周;Control组和DN组大鼠采用生理盐水灌胃,每日1次,连续给药12周。12周后检测各组大鼠血糖、尿素氮、肌酐、24 h尿蛋白和肾脏组织病理学变化、肾组织AGEs和RAGE含量以及RAGE蛋白表达。结果:数据库筛选得到WBGSF有效活性成分81个,与DN相关潜在作用靶基因148个,KEGG富集通路分析主要包括脂质-动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE信号通路以及流体剪切应力和动脉粥样硬化通路等。与Control组相比,DN大鼠血糖、尿素氮、肌酐以及24h尿蛋白含量均明显升高(P<0.01),肾组织出现明显的病理学改变,肾组织AGEs和RAGE含量升高,RAGE蛋白表达增加(P<0.01)。与DN组相比,WBGSF各剂量组大鼠血清相关生化指标降低,肾组织损伤得到明显恢复,AGEs和RAGE含量降低、RAGE蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)。结论:WBGSF具有多种活性成分,能通过多靶点、多通路发挥DN肾保护作用;动物实验证实,WBGSF能够改善DN肾损伤,其机制与调控AGE-RAGE信号通路相关。