温阳化浊通络方体外抑制HIF-1a/Foxm1/smad3信号通路改善系统性硬化病肺微血管损伤

目的利用系统性硬化病(systemic sclerosis,SSc)肺微血管内皮细胞缺氧模型,研究温阳化浊通络方抑制内皮细胞的内皮-间充质转化(EndoMT)改善肺微血管损伤的分子机制。方法利用SSc患者血清培养正常人肺微血管内皮细胞构建SSc肺微血管内皮细胞,液体石蜡封闭法建立SSc肺微血管内皮细胞缺氧模型,并分别用温阳化浊通络方含药血清或HIF-1a抑制剂KC7F2处理,Western blot检测VE-cadherin、CD31、vimentin、HIF-1α、Foxm1、smad3、Tie-1以及vWF的蛋白表达水平,ELISA检测细胞培养液中的E-selectin和ICAM-1的浓度,双荧光素酶报告基因系统检测Foxm1基因启动子活性。结果与对照组相比较,模型组细胞中的VE-cadherin、CD31、HIF-1a、Foxm1、smad3、Tie-1和vWF蛋白表达水平显著降低,vimentin蛋白表达水平以及细胞培养液中E-selectin和ICAM-1的浓度显著增高,同时细胞形态呈现出明显的“纺锤体样”成肌纤维细胞形态,而温阳化浊通络方和KC7F2能够逆转这些缺氧诱导的蛋白表达水平,以及细胞形态的改变。结论温阳化浊通络方能够改善SSc肺微血管损伤,其作用机制可能是抑制HIF-1a/Foxm1/smad3通路介导的肺微血管内皮细胞EndoMT。

温阳通络方治疗下肢动脉硬化闭塞症的临床观察

目的观察温阳通络方联合西洛他唑治疗下肢动脉硬化闭塞症(Peripheral Arterial Disease,PAD)的疗效。方法选择PAD患者150例,随机分为对照组74例,治疗组76例。对照组给予西洛他唑片50 mg,每日2次,口服。治疗组给予温阳通络方加减联合西洛他唑片50 mg,每日2次,口服。两组均以21 d为1个疗程。观察、比较两组临床疗效、跛行距离及踝肱指数(Ankle-Brachial Index,ABI)。结果治疗组显效率为85.6%,对照组为55.4%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01);两组治疗前、后跛行距离、ABI比较,差异有统计学意义(P<0.05),治疗后组间比较,治疗组优于对照组(P<0.05)。结论温阳通络方联合西洛他唑能显著改善PAD患者肢体缺血症状,增加组织灌流量,提高ABI,延长跛行距离。

温阳通络方联合加巴喷丁对糖尿病周围神经病变患者超敏C反应蛋白水平和PKC活性影响

目的探究温阳通络方联合加巴喷丁对糖尿病周围神经病变患者超敏C反应蛋白水平和蛋白激酶C活性的影响。方法选取2019年5月至2020年5月温州市中医院收治的糖尿病周围神经病变患者60例,通过随机数字表法分为单药组与联合组,每组30例。两组患者均行常规治疗,单药组使用加巴喷丁进行治疗,联合组在单药组基础上给予温阳通络方进行治疗。比较两组患者治疗前后的空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin,HbA1c)、中医证候评分、感觉神经传导速度(sensory nerve conduction velocity,SNCV)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、血清一氧化氮(serum nitric oxide,NO),检测患者治疗前后超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)水平、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性,对比两组治疗有效率。结果治疗后,联合组的FBG、HbA1c、主症评分及中医证候评分均低于单药组,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后两组SNCV均有改善,但与治疗前比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后,联合组的TNF-α、PKC、hs-CRP水平低于单药组,NO水平高于单药组,差异均有统计学意义(P<0.05)。联合组的治疗总有效率高于单药组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论对糖尿病周围神经病变患者使用温阳通络方联合加巴喷丁进行治疗,能够降低患者血糖水平,改善患者hs-CRP水平及PKC活性,降低机体炎症程度,治疗效果显著。

温阳化浊通络方对系统性硬化病小鼠Sema3A/Nrp1信号通路的影响

目的研究温阳化浊通络方(WYHZTLF)对系统性硬化病(systemic sclerosis,SSc)小鼠信号素3A(semaphorin 3A,Sema3A)/神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1,Nrp1)信号通路的影响,探讨其治疗SSc的作用机制。方法构建SSc小鼠模型,分为对照组、模型组、温阳化浊通络方低(21 g·kg^(-1))、中(42 g·kg^(-1))、高(84 g·kg^(-1))剂量组和Sema3A抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯组(epigallocatechol gallate,EGCG),连续灌胃给药4周,对照组和模型组给予生理盐水处理。HE染色观察皮肤病理损伤及真皮厚度;免疫组织化学法检测皮肤组织血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)表达水平;Western blot检测皮肤组织Sema3A、Nrp1及VEGFA的表达水平;ELISA法检测小鼠血清Sema3A表达水平。结果与模型组相比,温阳化浊通络方明显缓解了SSc小鼠的皮肤病变,对真皮厚度有明显的抑制作用,降低了皮肤组织VEGFA的蛋白表达水平,同时抑制了皮肤组织及血清中Sema3A/Nrp1信号通路的蛋白表达水平。结论温阳化浊通络方可能通过抑制Sema3A/Nrp1信号通路蛋白表达水平,降低VEGFA的表达,改善SSc血管损伤。

温阳化浊通络方治疗系统性硬化病的研究进展

本课题组创造性地提出“肺脾肾-皮毛”相关理论来阐释系统性硬化病的发病机制,并根据此理论研制了温阳化浊通络方治疗系统性硬化病,取得了良好的治疗效果。在此基础上,我们通过一系列研究阐释了温阳化浊通络方治疗系统性硬化病的作用机制。本文从理论基础、临床研究、药效物质基础研究、作用机制研究等方面对温阳化浊通络方治疗系统性硬化病的研究进展作详细总结。

温阳化浊通络方含药血清抑制硬皮病患者Th17细胞增殖的作用机制研究

目的研究温阳化浊通络方含药血清对维甲酸相关孤核受体(RORγt)表达及甲基化的影响,探讨其调控辅助性T细胞17(Th17)增殖从而治疗硬皮病的作用机制。方法分别灌胃Wistar大鼠15、30、60 g/(kg·d)温阳化浊通络方药液后制备不同剂量的含药血清,同时收集硬皮病患者外周血分选Th17细胞。以空白血清作为空白对照,甲基化转移酶抑制剂地西他滨(DCA)作为阳性对照,用不同剂量含药血清处理Th17细胞后,采用CCK-8法检测Th17细胞的增殖,采用qRT-PCR法检测细胞中RORγt、白细胞介素17(IL-17)mRNA的表达,采用Western blot法检测细胞中RORγt蛋白表达,采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中IL-17蛋白表达,采用甲基化特异性PCR法检测细胞中RORγt基因启动子甲基化水平,并采用双荧光素酶法检测细胞中RORγt基因启动子的转录活性。结果与空白对照比较,各剂量温阳化浊通络方含药血清和DCA均可抑制Th17细胞的增殖(P<0.05),降低RORγt、IL-17 mRNA及其蛋白的表达水平,提高RORγt基因启动子甲基化水平,减弱RORγt基因启动子转录活性;其中除含药血清低剂量组Th17 mRNA表达水平和RORγt基因启动子甲基化水平外,其余各组上述指标差异均有统计学意义(P<0.05)。结论温阳化浊通络方可通过促进RORγt基因甲基化,抑制RORγt表达及IL-17分泌,进而抑制Th17细胞的增殖。

基于“其在皮者,汗而发之”辨治痛性糖尿病周围神经病变

痛性糖尿病周围神经病变(PDPN)是糖尿病病程中常见的并发症之一,其西医发病机制尚未完全明确。中医多从寒凝血瘀、气虚血瘀、痰瘀互结等角度进行辨证论治,取得了一定的临床效果,但仍存在不足之处。吕树泉副主任医师基于“其在皮者,汗而发之”理论,论治PDPN,临床疗效确切。

温阳通络方对痛性糖尿病周围神经病变患者Hs-CRP水平、PKC活性影响

目的:探究温阳通络方联合加巴喷丁对痛性糖尿病周围神经病变(DPN)患者超敏C反应蛋白(Hs-CRP)水平、蛋白激酶C(PKC)活性影响。方法:选取2018年4月至2019年4月在我院接受治疗的痛性DPN患者60例,采用随机数字表法分为加巴喷丁治疗组与联合治疗组,各30例。在常规西药治疗的基础上,加巴喷丁治疗组使用加巴喷丁对患者进行治疗,联合治疗组在加巴喷丁治疗组的基础上给予温阳通络方进行治疗。4周为1个疗程,治疗周期为3个疗程。观察对比2组患者在治疗前后的空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、中医证候评分、感觉神经传导速度(SCV)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、血清一氧化氮(NO),检测患者治疗前后Hs-CRP水平、PKC活性,对比2组治疗有效率。结果:治疗后2组患者FBG、HbA1c值对比治疗前有明显下降(P<0.05)。治疗后2组患者主症评分及中医证候总分均明显降低(P<0.05)。治疗后2组患者的SCV有所改善,但结果显示2组患者治疗前后的差异无显著性(P>0.05);治疗后联合治疗组患者TNF-α值低于加巴喷丁治疗组(P<0.05)、NO值高于加巴喷丁治疗组(P<0.05);治疗后联合治疗组患者PKC、Hs-CRP值低于加巴喷丁治疗组(P<0.05)。联合治疗组患者治疗总有效率93.33%,高于加巴喷丁治疗组的73.33%(P<0.05)。结论:使用温阳通络方联合加巴喷丁对痛性DPN患者进行治疗,能够降低患者FBG、HbA1c、TNF-α水平值,改善患者的Hs-CRP水平和PKC活性,治疗效果显著。

温阳化浊通络方抑制系统性硬化病EndoMT的机制研究

目的:研究温阳化浊通络方抑制系统性硬化病(Systemic sclerosis,SSc)肺血管内皮细胞内皮-间充质转化(Endothelium-mesenchymal transformation,EndoMT)的效应和潜在分子机制。方法:利用博来霉素构建SSc小鼠模型,然后分别利用温阳化浊通络方或HIF-1α抑制剂KC7F2处理。采用masson染色观察小鼠肺组织纤维化程度。采用免疫组化检测小鼠肺组织和细胞中HIF-1α、Foxm1、smad3、VE-Cadherin、vimentin的蛋白表达水平。结果:在SSc小鼠模型中,温阳化浊通络方和KC7F2能够显著抑制小鼠肺组织的纤维化,并且下调肺组织中HIF-1α、Foxm1、smad3、vimentin的蛋白表达水平(P<0.05),同时上调VE-cadherin的蛋白表达水平(P<0.05)。结论:温阳化浊通络方能够抑制SSc肺血管内皮细胞EndoMT,其分子机制与其抑制HIF-1α/Foxm1/Smad3信号通路有关。

温阳通络利水方联合微波热疗治疗脾肾阳虚型恶性腹水临床观察

目的:观察温阳通络利水方联合微波热疗治疗脾肾阳虚型恶性腹水腹腔灌注化疗后的临床疗效。方法:收集符合纳入标准的脾肾阳虚型恶性腹水患者60例,随机分为两组各30例。对照组予以腹腔灌注化疗,治疗组在腹腔灌注化疗药物后行局部微波热疗,同时予以中药温阳通络利水方口服。治疗2个周期后,比较两组患者的临床疗效、不良反应及KPS评分。结果:治疗组的客观缓解率66.67%高于对照组的40.00%(P﹤0.05);治疗组KPS评分改善率高于对照组(P﹤0.05)。结论:中药温阳通络利水方联合微波热疗治疗脾肾阳虚型恶性腹水腹腔灌注化疗后临床疗效明显,可提升患者生活质量。

温阳化浊通络方对系统性硬化症模型小鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响

目的探讨温阳化浊通络方治疗系统性硬化症(SSc)的可能作用机制。方法将60只C3H/He小鼠随机分为正常组、模型组、西药组和中药低、中、高剂量组,每组10只。除正常组外其余各组给予皮下注射博莱霉素3周建立SSc小鼠模型。西药组小鼠灌服青霉胺片65 mg/(kg·d),中药低、中、高剂量组分别灌服温阳化浊通络方水煎剂11.75、23.50、47.00 g/(kg·d),模型组和正常组给予等体积的生理盐水,共干预8周。采用HE染色观察皮肤组织病理变化,采用RT-PCR法检测皮肤转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad2、Smad7 mRNA表达,采用Western blot法检测皮肤Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅰ、COL-Ⅲ)表达。结果模型组较正常组皮肤真皮变厚,胶原增加、变粗,真皮小血管周围炎症细胞浸润,西药组和中药低、中、高各剂量组与模型组比较真皮变薄、胶原含量减少,血管周围炎症细胞浸润减轻。与正常组比较,模型组TGF-β1、Smad2 mRNA及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达升高,Smad7 mRNA表达降低(P<0.01);与模型组比较,西药组和中药低、中、高剂量组TGF-β1、Smad2 mRNA及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达减少,Smad7 mRNA表达增加(P<0.05或P<0.01);中药高剂量组TGF-β1、Smad2、Smad7 mRNA及COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达改善优于西药组和中药低剂量组(P<0.05或P<0.01)。结论温阳化浊通络方可拮抗SSc纤维化,可能与干预TGF-β1/Smad信号通路、降低皮肤胶原蛋白含量有关,且高剂量效果更佳。

从肺脾肾-皮毛相关论治系统性硬化病的理论基础

文章分析了肺脾肾-皮毛相关理论的内涵,从中医病机学角度探讨肺脾肾-皮毛相关与系统性硬化病(SSc)的联系,认为肺脾肾阳虚,外邪侵袭,浊邪阻络,脉络不通是SSc的主要病因和病理基础,进而指出温阳化浊通络法是治疗SSc的主要方法,并从药理学的角度和临床的角度分析了基于肺脾肾-皮毛相关理论组方中药——温阳化浊通络方治疗SSc的理论基础。

温阳化浊通络方免疫抑制作用有效部位的筛选研究

目的:分离并筛选温阳化浊通络方治疗系统性硬化病免疫抑制作用的有效部位。方法:制备温阳化浊通络方水溶性部位、乙醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、乙醇部位等不同溶剂提取物。在体内研究中,采用小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型,观察温阳化浊通络方不同提取部位对细胞免疫和体液免疫的影响;体外研究检测温阳化浊通络方不同提取部位对Con A及LPS诱导的小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响。结果:温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位能够明显减轻DTH小鼠耳肿胀、降低小鼠的脾指数和胸腺指数(P<0.01)。同时温阳化浊通络方水溶性部位和正丁醇部位不同剂量组均可抑制T、B淋巴细胞增殖,且呈一定剂量依赖性。结论:温阳化浊通络方治疗系统性硬化病免疫抑制作用的有效部位可能是水溶性部位和正丁醇部位。

基于STAT3信号通路调节Th17细胞增殖探讨温阳化浊通络方治疗系统性硬化病机制

目的:研究温阳化浊通络方对Th17细胞增殖的影响,探讨其对STAT3信号通路的调控作用,明确该方治疗系统性硬化病(SSc)的免疫调控机制。方法:收集SSc患者外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,人Th17分选试剂盒分选Th17细胞,同时制备温阳化浊通络方含药血清。荧光染料CFSE标记Th17细胞后,流式细胞术检测含药血清对Th17细胞增殖的影响。采用RT-qPCR和细胞免疫荧光技术检测含药血清对Th17细胞中JAK2、STAT3/p-STAT3 mRNA和蛋白表达的影响。结果:与空白组比较,各剂量含药血清组可剂量依赖性地抑制Th17细胞的增殖(P<0.01);阳性对照组对Th17细胞的增殖抑制作用介于含药血清低剂量和高剂量组之间(P<0.01,P<0.05);各含药血清组可剂量依赖性地降低JAK2和STAT3 mRNA和蛋白的表达,并可剂量依赖性地降低p-STAT3的表达(P<0.05,P<0.01);阳性对照组抑制JAK2和STAT3/p-STAT3表达的作用强于各含药血清组(P<0.01)。结论:温阳化浊通络方可抑制Th17细胞的增殖,其机制可能与抑制STAT3信号通路有关。

基于Wnt/β-catenin通路探讨温阳泄浊通络方对慢性肾功能衰竭大鼠的干预作用

目的:观察温阳泄浊通络方对5/6肾切除致慢性肾功能衰竭大鼠的干预作用,并基于Wnt/β-catenin通路探讨其作用机制。方法:32只SD大鼠随机选取8只为假手术组,其余24只行5/6肾切除术建立慢性肾功能衰竭模型。造模完成后随机分为模型组、温阳泄浊通络方组、尿毒清组,并予以相应药物灌胃。干预12周后,取血检测肌酐、尿素氮、总蛋白及白蛋白;取肾组织,应用Western Blot法检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白Wnt4、p-GSK3β及TCF4的表达;免疫组化法、荧光定量PCR法检测Wnt/β-catenin通路下游靶基因纤维连接蛋白(FN)蛋白及mRNA的表达。结果:与模型组比较,温阳泄浊通络方可改善大鼠一般情况;可显著降低血肌酐、尿素氮(P<0.05),升高血总蛋白及白蛋白(P<0.05);并减轻肾脏病理损伤。此外,温阳泄浊通络方可抑制Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达(P<0.05)及FN蛋白、mRNA(P<0.05)的表达。结论:温阳泄浊通络方可保护CRF大鼠肾功能,改善肾脏病理损伤,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin通路的激活及其下游靶基因FN的表达相关。

温阳化浊通络方调控DNA甲基转移酶对硬皮病患者Treg细胞增殖的影响

目的:研究温阳化浊通络方(WYHZTLF)对DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)及叉头翼状螺旋转录因子3(forkhead box protein 3,FOXP3)表达的影响,探讨其调控硬皮病患者调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)细胞增殖的作用机制。方法:用Wistar雌性大鼠制备温阳化浊通络方含药血清。收集硬皮病患者外周血,分选Treg细胞,用含药血清处理后,通过CCK-8法检测含药血清对Treg细胞增殖的影响,免疫荧光法检测FOXP3蛋白表达,qRT-PCR法和Western blot法检测DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA及蛋白表达。结果:与空白血清组相比,低、中、高剂量含药血清组均可促进Treg细胞的增殖,中、高剂量组促进作用更加显著(P<0.05,P<0.01);低、中、高剂量含药血清组均可促进FOXP3蛋白表达(P<0.01);中、高剂量含药血清组明显抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B mRNA表达(P<0.05);高剂量含药血清组显著抑制DNMT1蛋白表达水平(P<0.05),低、中、高剂量组显著抑制DNMT3A和DNMT3B蛋白表达(P<0.01,P<0.01)。结论:温阳化浊通络方促进硬皮病患者Treg细胞增殖可能与抑制DNMT1、DNMT3A和DNMT3B表达从而促进FOXP3表达有关。

温阳化浊通络方抑制FOXP3甲基化促进Treg增殖治疗系统性硬化病的作用机制

目的:研究温阳化浊通络方对FOXP3甲基化的影响,探讨其调控Treg细胞增殖治疗系统性硬化病(SSc)的作用机制。方法:收集SSc患者外周血,采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞,用试剂盒分选Treg细胞,同时制备温阳化浊通络方含药血清。含药血清处理Treg细胞后,分别采用CCK-8检测Treg细胞增殖,qRTPCR检测FOXP3和IL-10 mRNA表达,Western blot检测FOXP3蛋白表达,ELISA法检测IL-10水平,甲基化特异性PCR检测FOXP3基因启动子区和TSDR区甲基化水平。结果:与空白组比较,温阳化浊通络方低、中、高剂量组显著促进Treg细胞的增殖(P<0.05,P<0.01),促进IL-10 mRNA和FOXP3蛋白表达(P<0.05,P<0.01);温阳化浊通络方高剂量组显著促进FOXP3 mRNA表达(P<0.01),抑制FOXP3 TSDR区甲基化水平(P<0.05);温阳化浊通络方中、高剂量组显著增加IL-10水平(P<0.05,P<0.01)。结论:温阳化浊通络方可促进Treg细胞的增殖,其机制可能与抑制FOXP3甲基化、促进FOXP3表达有关。

温阳化浊通络方对硬皮病模型小鼠皮肤Th17细胞及相关细胞因子的影响

目的:探讨温阳化浊通络方对硬皮病模型小鼠皮肤T细胞辅助细胞17(Th17)及相关细胞因子的影响。方法:将60只小鼠随机分为空白组、模型组、miR-155antagomir抑制剂组(250 nmol/3 d)和温阳化浊通络方组(低、中、高剂量分别为21、42、84 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组10只。使用盐酸博来霉素建立硬皮病模型。连续给药3周后,取小鼠皮肤组织进行HE染色、应用免疫组化检测白细胞介素(IL)-6和IL-17含量、应用流式细胞术检测Th17细胞比例、应用实时荧光定量PCR(qPCR)检测皮肤miR-155及IL-6、IL-17 mRNA的相对表达量。结果:S S C模型小鼠皮肤炎症水平远高于正常小鼠。免疫组化显示,硬皮病模型组I L-6、I L-17含量高于正常小鼠(P<0.01);温阳化浊通络方可有效降低IL-6、IL-17含量(P<0.01)。模型组皮肤CD4+IL17+Th17细胞比例,miR-155、IL-6及IL-17 mRNA相对表达量显著高于空白组(P<0.01,P<0.05),温阳化浊通络方中、高剂量组可有效降低上述指标(P<0.01)。结论:温阳化浊通络方可能通过抑制硬皮病模型小鼠皮肤miR-155、IL-6、IL-17基因表达,进而调控Th17细胞,影响皮肤成纤维细胞增殖,减缓硬皮病模型小鼠皮肤纤维化进程。