Southern印迹杂交及其他相关印迹技术简介

Southern印迹杂交（Southern blot）是分子生物学领域中最常用的技术方法之一，该技术是1975年英国爱丁堡大学的E．M．Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。后来相继出现了三个原理、过程相似，但是操作对象不同的印迹方法，缘于学界前辈的幽默分别将其称为Northern blot、Western blot和Eastern blot，这些技术的命名与发明人姓氏并没有关系。本文简要介绍了Southern印迹杂交及其相关生物技术。

马铃薯S病毒外壳蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以田间采集的马铃薯病叶中提取的马铃薯病毒S(PVS)总RNA为模板,通过RT-PCR获取长度为890 bp的PVS-cp的cDNA,克隆至pGEM-T载体上。酶切回收该基因片段,并构建了该基因的原核表达质粒pBV-pvs。SDS-PAGE凝胶电泳和Western印迹分析表明:PVS-cp基因在大肠杆菌JM109中可特异地高效表达分子量约33kD的蛋白,且表达蛋白具有良好的抗原活性。利用该表达产物免疫动物家兔,获得的抗血清可用于大田马铃薯S病毒的快速检测。

A组轮状病毒结构蛋白基因在马铃薯细胞中的初步表达

目的 在马铃薯细胞中表达轮状病毒结构蛋白。方法 采用RT PCR扩增截短VP4 蛋白基因 ,克隆于植物表达载体pBI2 2 1,再双酶切pBI2 2 1,将带有CaMV35S启动子、外源基因及终止子的片段转入pSB11,通过三亲杂交方法 ,制备农杆菌转化载体pSB111 VP4 ,并对pSB111 VP4 作点杂交检测 ,筛选鉴定重组子 ,对马铃薯组织细胞进行转化。结果 转化细胞经Western印迹检测其免疫活性 ,具有良好的抗原性。结论 为研制轮状病毒重组疫苗、亚单组疫苗。

大肠癌细胞表达的Fas配体具有功能性

目的 :探讨大肠癌细胞 Fas配体 (Fas L ) m RNA和蛋白的表达及其功能。方法 :分别采用 RT- PCR和 Western印迹法以及氚释放细胞活性测定技术检测大肠癌细胞株中 Fas L m RNA和蛋白的表达及其功能。结果 :所检测的 6株大肠癌细胞(RPMI 4788、HCT- 116、DL D- 1、L o Vo、Wi Dr和 COL O 32 0 DM)全部表达 Fas L m RNA和蛋白 ;DL D- 1,L o Vo和 Wi Dr等部分大肠癌细胞具有 Fas依赖的细胞毒活性。其中 DL D- 1细胞活性具有量效关系 ,并且乙酸肉豆蔻佛波醇 (PMA )和离子霉素(ionom ycine )刺激能显著增强 DL D- 1的细胞活性。结论 :DL D- 1、L o Vo和 Wi Dr等 3株大肠癌细胞表达功能性 Fas配体 ,并可能以此反击机体免疫系统 ,逃避免疫监督。

携带幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建

目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(ureB)基因重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA扩增ureB基因,克隆入pUCmT载体,检测ureB基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定。重组载体pIRES ureB转入减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,再次转入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES ureB转染COS 7细胞,SDS PAGE Western 印迹法检测pIRES ureB表达蛋白的免疫原性。结果 扩增出长约1700 bp的ureB基因,测序结果表明扩增出的ureB基因与基因库Hp ureB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实ureB基因克隆入真核表达载体pIRES,并成功构建了Hp ureB基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,并且Western印迹法检测到特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的Hp UreB减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其体内的免疫作用奠定了基础。

黄癸素联合5氟尿嘧啶对腺样囊性癌细胞的影响

观察黄癸素联合5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞的协同抑制作用,并初步探讨其与P53蛋白表达的关系。采用MTT法检测黄癸素联合应用5-氟尿嘧啶对体外培养人涎腺腺样囊性癌细胞Acc-3细胞增殖的抑制作用,计算IC50和联合指数(CI值)判断药物协同作用效果;应用westem印迹法分析P53蛋白的表达。结果显示,与二药单用比较,黄癸素联用5氟尿嘧啶对Acc-3细胞的抑制作用更显著,IC50显著降低,二药联用对癌细胞株的CI值均小于1,表现为较显著的协同效果。同时可观察到细胞核P53表达显著下降,该结果可能与二药在作用机制方面的协同有关。

地塞米松对哮喘豚鼠肺及内脏感觉传入系统神经生长因子表达的抑制作用

目的:探讨地塞米松对哮喘豚鼠肺及内脏感觉传入系统(C7T5脊神经节及对应的脊髓后角)神经生长因子(NGF)表达的影响。方法:利用免疫组织化学和Western印迹方法,观察生理盐水组、单纯致敏组、哮喘组和地塞米松组豚鼠肺及内脏感觉传入系统(C7T5脊神经节及对应的脊髓后角)NGF表达的变化。结果:哮喘组豚鼠NGF在肺及内脏感觉传入系统(C7T5脊神经节及对应的脊髓后角)表达明显高于对照组,而地塞米松组则明显低于哮喘组。结论:NGF可能参与哮喘的发病过程,地塞米松抑制哮喘豚鼠NGF的表达可能是其治疗哮喘的机制之一。

NFkB家族蛋白对乳腺癌细胞发生及耐药的影响

目的 :研究NFkB家族蛋白在乳腺癌细胞的表达及与乳腺癌细胞化疗耐药性关系。方法 :培养 14个乳腺癌细胞系 ,对其进行胞浆、胞核蛋白质提取 ,Western印迹法观察NFKB家族蛋白及其抑制物的表达 ,并用MTT药敏实验观察NFkB家族蛋白与乳腺癌细胞化疗耐药性关系。结果 :p5 0、p65和IkB在细胞浆内表达阳性率分别为 10 0 %、71%和 5 0 % ,p5 0、p65同时在胞核内表达 ,p5 0尤为明显 ,阳性率分别为 63%和 35 % ;5个乳腺癌细胞系细胞核MTT检测IC50 值大于 2 0 μg/ml,p5 0表达全部阳性 ,p65 2例阳性 ;p5 0胞核表达阳性者的IC50 值明显高于胞核表达阴性 ,而 p65无明显关系。 结论 :p5 0在乳腺癌细胞的发生中起一定作用 ,且与乳腺癌细胞的耐药关系密切 。

琥珀酰辅酶A转移酶的表达纯化及抗体制备

目的:琥珀酰辅酶A转移酶(SCOT)是酮体代谢过程中的关键限速酶,此酶缺陷多由SCOT基因突变引起,患者多有酮症酸中毒表现。为了进一步研究SCOT的功能,采用原核表达系统表达并纯化重组SCOT,制备SCOT多克隆抗体。方法:选择蛋鸡、肉鸡模式生物为研究对象,通过生物信息学对其抗原性和属间同源性进行分析,通过RT-PCR从鸡的骨骼肌cDNA中扩增了SCOT基因N端半长片段,克隆到表达载体pET28b中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组SCOT;用纯化的重组SCOT免疫小鼠后得到多克隆抗体。结果:Western印迹表明,制备的SCOT抗体具有较高的特异性,可特异性识别鸡的SCOT蛋白,同时可特异性识别小鼠和人的相应SCOT蛋白。结论:SCOT多克隆抗体的制备为后续在鸡、鼠和人中研究SCOT基因提供基础。

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。

刀额新对虾变应原的分离、鉴定与纯化

目的通过对我国常见的刀额新对虾变应原蛋白进行分离、鉴定与纯化,以提供虾特异性变应原用于食物变态反应疾病的诊断和治疗。方法通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离刀额新对虾的蛋白质组分并测定其分子量,收集过敏病人血清,采用免疫印迹(Western-blotting)法鉴定其变应原成分,通过离子交换层析对刀额新对虾变应原进行初步纯化,通过疏水层析和凝胶过滤层析进一步对变应原纯化。结果刀额新对虾有17条蛋白带,其中主要条带有10条,68和36 kD为可与虾过敏性病人血清IgE结合的特异性变应原;通过各种层析方法纯化出刀额新对虾68 kD变应原,纯度为96%。结论对刀额新对虾变应原进行分离、鉴定和纯化,得到高纯度的68 kD刀额新对虾变应原,为临床虾变态反应疾病的诊断和治疗奠定基础。

肢带型肌营养不良和Miyoshi肌病dysferlin表达分析

目的探讨 dysferlinopathy 的临床、病理及分子病理特征。方法对45例临床病理诊断为肢带型肌营养不良(LGMD)和 Miyoshi 肌病(MM)患者的冰冻肌肉标本通过免疫组化染色(IHC)观察 dysfedin、α-肌聚糖和肌营养不良蛋白(dystrophin)的表达,进一步用 Western 印迹分析法(WB)测定肌肉组织中 dysfedin 含量。结果在39例 LGMD 和6例 MM 患者肌肉标本中发现5例dysferlin 完全缺失,另有3例 dysferlin 表达量在正常对照值的15%以下,这8例患者符合dysferlinopathy 的诊断,其中 LGMD 3例,MM 5例。平均发病年龄为18.8岁,2例 LGMD 患者为同胞兄妹,1例 MM 患者的父母为姑表兄妹,提示本病属常染色体隐性遗传方式。血清 CK585～21 280IU/L,平均6240 IU/L,肌电图均显示肌源性损害,肌肉病理为典型肌营养不良改变,3例有炎细胞浸润。结论 dysferlinopathy 临床和普通肌肉病理缺乏特异性,部分患者肌组织中伴有炎细胞浸润,容易误诊为炎症性肌病。应用免疫组化和蛋白印迹方法对 dysferlin 的表达进行分析是诊断本病以及与炎症性肌病鉴别的必要手段。

抑癌基因VHL治疗实体肿瘤的实验研究

目的探讨抑癌基因VHL治疗EL-4实体肿瘤的效果。方法皮下注射EL-4淋巴瘤细胞建立C57BL/6小鼠实体肿瘤模型。当肿瘤生长至直径分别为0.1cm和0.4cm时,将小鼠随机分为治疗组和对照组,每组各6只。治疗组瘤体内采用脂质体法注射pcDNA3-VHL基因,对照组注射空载体,观察肿瘤生长情况。用免疫组织化学(免疫组化)和(或)Western印迹方法检测VHL基因、血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、抗凋亡因子(bcl-2)在瘤组织内的表达,测定肿瘤的微血管密度(MVD);TUNEL法测定肿瘤的凋亡指数(AI)。结果VHL基因治疗能够根除小的肿瘤(直径0.1cm),但只能减慢而不能消除较大肿瘤(直径0.4cm)的生长。治疗组VHL基因在瘤组织内高表达,VEGF、HIF-1α和Bcl-2的表达显著低于对照组,MVD明显低于对照组(P<0.05),AI显著高于对照组(P<0.01)。结论VHL基因疗法对小鼠EL-4实体肿瘤的生长有显著的抑制作用。