早/晚抽薹性大白菜自交系中光敏色素B及光周期关键基因的动态研究

光周期是影响植物抽薹开花最重要的环境因子之一,光周期信号通过植物的光敏色素蛋白调控植物的抽薹开花,其中PHYB介导的信号网络对植物抽薹开花有重要的抑制作用。前期研究发现,大白菜耐抽薹材料06-247与易抽薹材料He102的PHYB基因启动子存在大片段插入/缺失差异,为了进一步研究启动子突变对PHYB及其下游途径关键基因的影响,以耐抽臺材料06-247与极易抽臺材料He102为试验材料,采用生物信息法分析了大白菜基因组中光敏色素基因的冗余特点,发现大白菜基因组包含6个光敏色素基因,其中PHYA有2个拷贝,PHYB、PHYC、PHYD和PHYE都仅有1个拷贝。进一步通过氨基酸序列比对筛选出了PHYB的特异序列、设计了抗原决定簇并制备了抗大白菜PHYB的特异抗体,采用荧光定量RT-PCR技术和Western Blot技术研究了06-247与He102中PHYB的相对含量,同时比较了PHYB下游光周期通路关键调控基因CCA1、FLC、CO和FT的动态变化。结果表明:启动子突变造成PHYB在06-247中表达水平显著升高并进而造成PHYB蛋白水平显著升高,同时下游调控基因CCA1、FLC、CO和FT均在06-247中高水平表达,这对06-247的耐抽薹特性有重要影响。

一种改进的Western杂交方法

Western杂交是一种检测蛋白质的免疫化学方法,已在生物科学的许多领域得到广泛应用,但以前的文献介绍的Western杂交程序过于繁琐。本文根据Western杂交的基本原理结合已报道资料进行了一些改进,并应用到猪血清瘦素蛋白的检测。该程序简单易操作,结果清晰,证明改进后的方法完全可行。

西南山区输电线路岩石锚杆基础的几个问题探讨

梳理总结西南山区独特的地理地质环境特点,结合区域内输电线路工程实际,对岩石锚杆基础应用中坡度条件与边坡稳定性、覆盖层厚度与基坑安全性、水稳性差的软岩、施工过程、工代、安全度等几个主要问题进行计算分析与探讨,并提出相关建议。

SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化

目的克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建原核重组表达质粒pET23a-M,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达、纯化。表达产物用Western Blot检测其抗原性。方法RT-PCR扩增M编码基因目的片段,胶回收纯化,插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DH5α。序列测定后亚克隆至表达质粒载体pET23a,构建重组体pET23a-M,转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆,以限制性酶切分析鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物。结果PCR扩增出约675bp的特异性片段,与预期片段大小相符,测序鉴定无有义突变;所构建的pET23a-M重组体阳性克隆经PCR与双酶切鉴定,与预期结果一致;SDS-PAGE显示表达产物约27kD;表达产物经金属螯和层析纯化;免疫印迹表明表达产物能被混合的SARS病人恢复期血清识别。结论成功克隆了SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列,构建了pET23a-M表达质粒,诱导表达并纯化出了SARS冠状病毒M蛋白,并以免疫印迹鉴定。本研究的成功为进一步进行SARS病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础。

田鼠巴贝虫可溶性抗原组分分析及其初步应用

目的 分析田鼠巴贝虫可溶性抗原,寻找可用于免疫诊断的有效抗原组分.方法 用田鼠巴贝虫感染BALB/c小鼠,待虫血症达高峰期时,收集田鼠巴贝虫虫体;采用超声法制备可溶性粗抗原（soluble babesia antigens,SBA）并包板,ELISA检测血清特异性IgG,评价SBA的免疫反应性、交叉反应性和特异性;以SDS-PAGE电泳分析SBA组分,并进行Western Blot,分析其与感染鼠血清的反应性.结果 SBA-ELISA法可检测早期感染（7 d）小鼠血清,且与恶性疟、间日疟弓形虫病阳性血清无交叉反应,显示出其较好的诊断敏感性和较高的特异性.通过SDS-PAGE分析,获得5条分子质量为72、66、60、53、43 kDa的主蛋白带和介于14.4～116 kDa的7条次带.经Western Blot分析,SBA有15个抗原组分能被阳性小鼠血清识别,以72、53、43、39、30 kDa蛋白组分反应较强.结论 以SBA建立的间接ELISA可用于巴贝虫感染的有效筛查工具;田鼠巴贝虫可溶性抗原组分中72、53、43、39、30KDa为比较理想的抗原组分.

S100钙结合蛋白A2在胃癌组织中的表达及意义

目的:探讨S100A2在慢性胃炎、肠上皮化生和胃癌组织样本中的表达及与胃癌临床病理特征及预后的关系。方法:利用HE染色对所取胃组织标本进行病理组织学诊断;采用免疫组织化学方法检测标本S100A2蛋白的表达;qRT-PCR法检测S100A2 mRNA表达;Western blot检测S100A2蛋白的表达;采用Kaplan-Meier分析累积生存率。结果:应用qRT-PCR方法分析不同胃组织标本S100A2 mRNA的表达水平,发现S100A2 mRNA的表达水平按以下顺序递减:胃炎,肠上皮化生,胃癌(P<0.001),与Western bolt分析S100A2蛋白的表达评定结果相吻合。免疫组化分析:S100A2在胃炎、肠上皮化生和胃癌组织细胞质中表达,S100A2阳性表达率为胃炎100%(73/73),肠上皮化生90.7%(78/86),胃癌48.9%(170/348)(P<0.001)。在胃癌中,S100A2蛋白的表达缺失在青年患者中多于老年患者。S100A2蛋白的表达与肿瘤大小、浸润深度、淋巴管和静脉浸润、淋巴结转移、肿瘤TNM分期呈负相关,并随胃癌分化程度降低,在高分化癌、中分化癌和低分化癌中,S100A2的阳性表达率分别为65.9%、56.4%和17.2%(P<0.05),和患者性别无相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier分析累积生存率显示:弱或中度S100A2基因表达的患者累积生存率明显高于不表达S100A2的患者。多因素分析显示S100A2表达、浸润深度、淋巴管及静脉浸润、淋巴结转移、TNM分期是胃癌患者预后的独立因素。结论:在胃炎-肠上皮化生-胃癌过程中S100A2 mRNA和蛋白表达逐渐降低。S100A2表达与肿瘤大小、浸袭深度、淋巴管和静脉侵犯、淋巴结转移及TNM分期负相关,并随胃癌分化程度降低,S100A2的阳性表达率逐渐降低。S100A2表达是独立的胃癌预后预测因素,是胃癌患者预后良好的指标之一。

LKB1在甲状腺乳头状癌中表达及意义

目的探讨LKB1在甲状腺乳头状癌中的表达特点及其生物学意义。方法甲状腺乳头状癌和正常甲状腺组织标本各25例,采用免疫组织化学、Western blot和real-time PCR检测比较LKB1蛋白表达及mRNA情况。结果人甲状腺乳头状癌组织中LKB1蛋白表达显著低于正常甲状腺组织(P<0.05),其mRNA明显下调(P<0.01),LKB1表达与甲状腺乳头状癌淋巴结转移呈负相关(P<0.01)。结论 LKB1基因和蛋白表达水平在甲状腺乳头状癌组织中普遍下调并与其淋巴结转移呈负相关,提示LKB1在甲状腺乳头状癌的形成及淋巴结转移中起负向调节作用。

pET-32a载体介导的生长抑制素基因在大肠杆菌中表达

为构建pET-32a-2SS28-SS14和pET-32a-3SS28原核表达质粒并检测其在大肠杆菌中的表达,将两种形式的生长抑制素SS14和SS28基因克隆到pET-32a载体中;酶切及测序鉴定后,采用不同终浓度的IPTG在37℃条件下进行诱导表达。Western blot结果显示:两组分别诱导出分子量大小为28.4 kD和29.8 kD的目的蛋白,不同终浓度的IPTG诱导对目的蛋白的表达量没有明显影响。目的蛋白主要为可溶性蛋白,少数以包涵体形式存在。本研究为生长抑制素基因工程疫苗生产应用奠定了基础。

人工培植冬虫夏草水提物抗人巨细胞病毒的研究

研究人工培植冬虫夏草水提物对人类巨细胞病毒(HCMV)的抑制作用,并对其抑制机制进行初步研究。通过细胞病变法(CPE)检测虫草水提物的细胞毒性及抗病毒活性,同时采用免疫印迹实验(Western Blot-ting)初步探究虫草水提物抗HCMV的作用靶点。结果表明虫草水提物浓度在0.3 g.L-1以上时能有效抑制HCMV在宿主细胞中的复制,用虫草水提物处理感染的宿主细胞,HCMV的早期立即蛋白IE1、IE2及早期蛋白UL84的表达均明显受到抑制。虫草水提物可作为潜在的抗HCMV药物。

口腔鳞癌p16基因的表达及其病理意义

目的 探讨 p16基因在口腔鳞癌中的表达情况及其病理意义。方法 利用原位杂交和 Western blot-ting技术检测了 48例口腔鳞癌标本和 6例正常口腔粘膜标本 p16基因 m RNA的分布和强度及 p16蛋白的表达 ,并分析了 p16蛋白表达和患者临床病理参数的关系。结果 6例正常口腔粘膜 p16 m RNA表达均阳性 ;48例口腔癌标本中有 2 1例 p16 m RNA表达阴性 (4 3.7% ) ,2 6例无 p16蛋白表达 (5 4.2 % ) ,其中 2 1例 m RNA表达阴性的病例均无 p16蛋白表达 ,另外 5例无 p16蛋白表达的鳞癌组织有 p16 m RNA杂交信号 ;p16蛋白表达与肿瘤的部位、癌细胞的分化程度及临床分期均无关 ,但与颈淋巴结是否转移密切相关 (P<0 .0 1)。结论 p16基因产物丧失常发生于口腔鳞癌 ;p16基因可能通过某种机制抑制癌细胞的转移特性。

新基因BP1抗体制备及其在乳腺癌表达的初步观察

为了探讨新同源盒基因BP 1在乳腺癌的表达,运用生物信息学方法设计19肽,合成并偶联到大分子载体KLH上制成人工免疫原,制备兔抗BP 1多克隆抗体IgG.蛋白印迹方法检测BP 1在乳腺癌细胞系M CF 7、M DA-M B-231细胞均有表达:免疫组织化学结果显示,BP 1蛋白在乳腺癌的表达率显著高于癌旁组织,在雌激素受体阴性肿瘤的表达率高于雌激素受体阳性组。BP 1基因的异常表达参与了乳腺癌的发生,是一种新的乳腺癌分子标志物.

PEBP4、CR-1在食管癌中表达的临床意义

目的探讨磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(PEBP4)、畸胎瘤衍化生长因子(CR-1)在食管癌组织中表达的临床意义。方法选取食管癌组织(癌组织组)及正常食管黏膜组织(正常组)各30份,分别采用免疫组化法、蛋白质印迹法检测各组PEBP4、CR-1表达水平。结果癌组织组PEBP4表达阳性率为83.3%,显著高于正常组的20.0%(P<0.05);有淋巴结转移及远处转移的癌灶PEBP4表达阳性率显著高于无淋巴结转移及无远处转移癌灶(P<0.05)。癌组织组CR-1表达阳性率为86.7%,显著高于正常组的16.7%(P<0.05);有淋巴结转移及远处转移的癌灶CR-1表达阳性率显著高于无淋巴结转移及无远处转移癌灶(P<0.05)。癌组织组CR-1 mRNA及其蛋白相对表达水平均显著高于正常组(P<0.05)。结论食管癌组织中PEBP4、CR-1阳性表达率较高,对食管癌的早期诊断及预后判断有较高临床价值。

星形胶质细胞上调基因-1表达与食管鳞状细胞癌预后的相关性研究

目的：探讨食管鳞状细胞癌组织中星形胶质细胞上调基因-1（AEG-1）的表达情况及其与临床分期、预后的相关性。方法：应用半定量RT-PCR、Western blotting及免疫组织化学技术检测AEG-1基因在食管鳞状细胞癌组织中的表达情况,并与肿瘤临床分期特征及预后进行相关性分析。结果：食管鳞状细胞癌组织中AEG-1 mRNA及蛋白表达量分别为癌旁正常组织的8.2-18.5倍及4.6-13.2倍。76例食管鳞状细胞癌石蜡包埋组织中AEG-1蛋白表达阳性占70例。AEG-1在男性患者中的表达强度强于女性患者,在中晚期病变中的表达强度强于早期病变,另AEG-1表达强度与患者生存时间呈负相关。结论：AEG-1不仅可以用于预测食管癌患者预后,也可能成为一个潜在的基因治疗靶点。

血管抑素对血管内皮细胞中的VEGF表达的影响

目的:探讨不同浓度的血管抑素对血管内皮细胞中VEGF表达的影响。方法:将体外培养的人脐静脉内皮细胞分为三组:对照组(空白组)、A组(16mg/L血管抑素组)、B组(32mg/L血管抑素组),通过MTT、RT-PCR、Western-Bolt等方法检测细胞内VEGF的表达情况。结果:随着血管抑素作用时间的延长和浓度的递增对人脐静脉内皮细胞的抑制作用也逐渐增强,且与对照组相比差异均有显著性意义(P<0.05)。结论:血管抑素通过抑制VEGF的表达以抑制人脐静脉内皮细胞增殖,从而抑制血管新生。

川西高原地区早市棒菜新品种比较试验

为筛选出适合川西高原地区早市栽培的优质、高产、耐抽薹棒菜新品种,在四川理县引进8个棒菜新品种进行田间比较试验。试验结果表明,花叶B34棒菜、金田棒菜3号综合评价较高,耐抽薹性、产量、净菜率、食用茎长、食用茎粗等指标在供试品种中表现较佳,适合在川西高原地区推广种植。

风湿性心脏病心房颤动患者心房肌HCN2通道的表达变化

目的通过研究风湿性心脏瓣膜病(风心病)心房颤动(Af)患者心房肌超极化激活环核苷酸门控通道-2(HCN2)的表达变化,探讨其与Af发生维持的关系,为分析Af发生维持的机制奠定理论基础。方法选取风心病二尖瓣狭窄患者42例,根据是否合并Af将其分为两组,Af组23例,窦性心律组19例,术中取右心耳组织,应用蛋白质免疫印迹法(Western blot)分别测定两组HCN2通道的表达水平。结果 Af组和窦性心律组中HCN2通道在心房肌组织中的相对表达量分别是(0.45±0.19)和(0.24±0.12),两组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论心房肌组织中HCN2通道的表达上调,可能是风心病Af的分子机制之一,参与调控Af的发生和维持。

对BIV－Gag和Env抗原特异性抗体的免疫检测

本文用高效表达载体表达出的融合ＢＩＶ核心蛋白（ＴｒｐＥ－Ｇａｇ）和外膜蛋白（ＴｒｐＥ－Ｅｎｖ）作为ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ检测的抗原，分别对Ⅰ、Ⅱ两口岸进口奶牛及后代进行了流行病学调查，发现用外膜蛋白检测阳性率比核心蛋白阳性率略高，进一步的追踪调查表明核心蛋白的抗体水平在减弱的同时外膜蛋白的抗体有加强的趋势。

Rab23基因在胶质瘤中的表达分析

目的研究Rab23基因在胶质瘤组织中的表达,探讨Rab23基因与胶质瘤临床病理学特征间的关系。方法采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测78例不同级别脑胶质瘤病人的肿瘤组织以及30例正常成人脑组织中的Rab23蛋白和mRNA表达情况。分析Rab23基因表达与胶质瘤病人临床参数(包括年龄、性别、肿瘤大小、部位、术前KPS评分、病理级别)的关系。采用Kaplan-Meier统计方法分析Rab23 mRNA的表达及临床参数与胶质瘤病人总生存期的关系。进一步对病理分级及KPS评分进行多因素分析。结果胶质瘤组织中Rab23 mRNA中的平均表达量为0.532±0.028,正常脑组织的平均表达量0.199±0.039,差异有统计学意义(P<0.05);低级别组与高级别组Rab23 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测显示:Rab23蛋白在胶质瘤中的表达明显增高;正常脑组织Rab23蛋白分别与低级别组、高级别组比较,差异均有显著性(P<0.01),低级别组Rab23蛋白与高级别组比较,差异有显著性(P<0.01)。Rab23 mRNA表达水平与病人的年龄、性别、肿瘤大小、部位、术前KPS评分等不相关。Rab23高表达的病人其生存时间显著短于低表达组(P=0.0042)。结论 Rab23 mRNA及蛋白在脑胶质瘤组织中高表达,且其表达水平与病理分级相关。Rab23可作为判定胶质瘤恶性程度及进程的参考指标。

富水弱胶结顶板巷道支护优化设计研究

为了解决西部煤矿富水弱胶结顶板巷道支护优化设计的问题,通过对西部煤矿富水弱胶结顶板取芯岩石试件试验研究,得出其岩石试件在浸水24h后即达到浸水饱和状态,在垂向上易发生膨胀变形离层,且单轴抗压强度较常态下降低了18.9%。根据试验结果及现场实际地质情况,提出了断面优化、顶板支护锚固力增强优化技术、巷道的梯度锚固优化技术这三种针对性的巷道支护优化设计。现场观测结果表明:在经过巷道支护优化后,巷道掘进期间顶板浅深部离层绝大多数都在0~10mm内分布,巷道围岩锚杆(索)增幅载荷大部分在11~30kN分布,均在锚杆及锚索的承载能力范围内,巷道掘巷期间矿压显现不明显。实现了巷道掘进安全支护,同时为西部煤矿富水弱胶结顶板巷道支护进行了优化支护实践论证。

白香丹胶囊对经前期综合征肝气逆证大鼠下丘脑GABA_ARβ_2亚基分布及表达的影响

目的:研究白香丹胶囊对经前期综合征(PMS)肝气逆证模型大鼠下丘脑γ-氨基丁酸A受体(GABAAR)β2亚基蛋白分布和蛋白、mRNA表达的影响及PMS肝气逆证发病中枢机制。方法:以免疫荧光技术(IF)、蛋白印迹技术(Western blot)、半定量逆转录多聚合酶链式反应(半定量RT-PCR)依次检测大鼠下丘脑GABAARβ2亚基蛋白的分布模式,蛋白、mRNA的表达水平。结果:与正常组比较,肝气逆组大鼠下丘脑GABAARβ2亚基主要分布在下丘脑组织的边缘,蛋白、mRNA表达水平显著升高;造模同时给予白香丹胶囊后,受体蛋白在下丘脑中均匀分布而趋于正常,蛋白、mRNA表达水平有不同程度的降低。结论:GABAARβ2亚基蛋白分布异常,蛋白、mRNA表达上调可能是PMS肝气逆证发病中枢机制之一,白香丹胶囊可以对上述异常变化起纠正作用。