大鼠移植骨髓细胞向肝细胞转化的实验研究

目的 探讨体内骨髓细胞向肝细胞转化的可行性。方法 将雌性 SD大鼠随机分为3组,每组15只。①R+BMT(全身照射+骨髓移植);②2-AAF+R+BMT:③2-AAF+PH(部分肝切)+BMT。进行交叉性别骨髓细胞移植,雄性骨髓植入雌性受体,分别于第5、10、20天处死雌鼠。以雄性性别决定基因sry作为细胞标记,用原位杂交和FISH作为检测方法对骨髓细胞的肝细胞转化进行分析。结果 PCR移植效果初步分析可见,R+ BMT组11例中有10例PCR阳性;2AAF+PH+BMT组11例中有7例阳性,2AAM+R+BMT组10例中有6例阳性。sry原位杂交染色发现,第5天各组雌性受体肝索中均未见sry阳性的肝细胞。第10天R+BMT组可见1例sry阳性的细胞位于肝细胞索,FISH染色可见这一细胞白蛋白mRNA阳性。第20天各组PCR阳性各例均可在肝索中检测到sry阳性的细胞。FICH染色可见白蛋白mRNA阳性。经统计学分析第20天各组sry阳性细胞数无明显差异。结论 在R+BMT、2-AAF+PH+BMT和2-AAF+R+BMT模型中移植的骨髓细胞均可以植入肝脏,并存在于肝细胞索。植入肝索的骨髓细胞最早可见于移植后第10天,并发生转分化,表达白蛋白mRNA。不经过全身照射的2-AAF+PH+BMT组,移植的骨髓细胞也可以进入肝脏发生转分化,因此全身照射并不一定是移植骨髓细胞活化、植入和转化的必须条件。

肝癌特异性AFP亚型测定方法及诊断价值研究

目的 :研究肝癌特异性甲胎蛋白 (AFP)亚型 (HS-AFP)对原发性肝细胞癌 (PHC)的诊断和鉴别诊断价值。方法 :建立聚丙烯酰胺凝胶电泳和 Western blot分离检测血清 HS-AFP的方法 ,对 82例 PHC和 95例良性肝病患者 HS-AFP进行分离检测 ,分析 HS-AFP与血清 AFP浓度、肿瘤大小及门静脉转移的关系。结果 :肝癌患者 HS-AFP阳性者为 74.4% ,明显高于良性肝病(肝硬化、慢性肝炎和急性肝炎的阳性率分别为 9.1%、7.3 %和 10 .0 % )。 HS-AFP与血清 AFP浓度和肿瘤大小有一定相关性 ,而与有无门静脉转移关系不大。结论 :HS-AFP可提高 AFP阴性 PHC和早期 PHC的诊断敏感性 ,尤其对良恶性肝病所致的 AFP升高有较高鉴别诊断价值。

甲胎蛋白AFP的原核表达、纯化及鉴定

为实现甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)在原核系统中高效表达,在GenBank上查找AFP全基因序列(GenBank登录号:NM_001134.2),分析AFP基因序列及大肠杆菌密码子偏好性优化,化学合成AFP全基因。以pET28a(+)作为原核表达载体并转化至BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达。利用镍柱纯化AFP重组蛋白,并对纯化的AFP重组蛋白进行SDS-PAGE纯度分析、BCA蛋白浓度测定、Western-blot特异性鉴定。结果表明:AFP重组质粒经过Nde I、Xhol I双酶切鉴定,在1875 bp处出现特异性条带,与预期相符合;当诱导条件为30℃,0.1 mM的IPTG,诱导8 h,AFP重组蛋白可大量表达;BCA法测得AFP重组蛋白浓度达0.9239 mg/mL;纯化后的AFP重组蛋白与市售的AFP单抗进行Western blot鉴定,结果显示在75 kD处有明显的蛋白印迹,pET28a(+)/BL21(DE3)空白组无条带,表明AFP重组蛋白可在大肠杆菌中高效表达,且经Ni柱纯化后具有良好的特异性。研究实现了AFP重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,为后续AFP的检测、以AFP为分子靶点的抗癌药物筛选奠定了基础。