室内煤烟污染相关肺癌患者血清中rasp21和p53蛋白的Western免疫印迹检测

用Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹技术检测了接触室内煤烟的肺癌患者１９例（肺癌组）和未患肺癌者２２例（非肺癌组）以及不接触煤烟的未患肺癌者１９例（对照组）血清中的ｒａｓｐ２１癌基因蛋白和ｐ５３抑癌基因蛋白。结果显示：肺癌组血清中ｐ２１和ｐ５３蛋白含量明显高于其他两组人群（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；肺癌组ｐ２１和ｐ５３蛋白阳性样品数各为６例，非肺癌组ｐ２１蛋白阳性样品数为２例。验证了本室以前采用酶联免疫斑点法进行初步筛检的结果，表明血清中癌基因蛋白和抑癌基因蛋白可作为环境相关肺癌的生物标志。

研究生实验教学中细胞转染技术结合斑点免疫印迹技术的实验探索

在研究生组织及细胞培养实验教学中,细胞转染技术是一个重要的组成部分,以往实验方案使用携带荧光蛋白GFP基因的质粒转染细胞后,可使用荧光显微镜进行观察定性分析转染是否成功并粗略计算转染效率,但对于没有荧光标记的细胞转染结果分析检测方法在教学上尚有欠缺。本实验针对这个问题,在检测方法中加入斑点免疫印迹技术,并对实验方案及分析方法进行了探索,以便于学生掌握更全面的细胞生物学分析技术。

纳米氧化硅表面自组装噻吩磺隆分子印迹材料电致化学发光免疫传感器

以噻吩磺隆(TFM)为模板,α-甲基丙烯酸(MAA)为功能单体,在纳米氧化硅(SiO_2)表面自组装聚合TFM分子印迹膜,组建新型纳米氧化硅表面分子印迹材料电致化学发光(ECL)免疫传感器。结合扫描电子显微镜及紫外光谱分析优化了自组装的试验条件。取制备好的纳米SiO_2 100 mg,超声分散在50 mL无水甲苯中,迅速加入0.8 mL(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTS),在氮气保护下,于130℃回流24 h,得到表面改性的纳米氧化硅产物(APTS-SiO_2),用无水乙醇和乙腈分别洗涤3次,干燥24 h。取20 mg APTS-SiO_2,超声分散在50 mL乙腈中,加入TFM 0.1 mmol、MAA 0.4 mmol、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)1.6 mmol、引发剂2,2-偶氮二异丁腈(AIBN)15 mg进行聚合反应,再用50 mmol·L^(-1)氢氧化钠-甲醇溶液洗脱模板分子,洗涤,离心得到中性的分子印迹材料TFM@Si-MIP。将TFM@Si-MIP的分散溶液滴加到打磨好的玻碳电极(GCE)表面,用红外灯烘干后即为TFM分子印迹材料修饰的传感器TFM@Si-MIP-ECL。组建的表面分子印迹材料电致化学发光免疫传感器结合鲁米诺体系实现了对TFM的高灵敏检测。结果表明,该分子印迹电致化学发光免疫传感器对目标分子具有较强的选择性,有效避免其他组分干扰。TFM的浓度在1.0×10^(-10)~1.0×10^(-7) mol·L^(-1)内,其对数与电致发光信号强度的对数呈线性关系,检出限(3S/N)为8.6×10^(-11) mol·L^(-1)。按照标准加入法对环境水样进行回收试验,回收率为94.1%~109%,测定值的相对标准偏差(n=7)均小于5.0%。

乙酰胆碱受体抗体斑点免疫印迹法的建立与评价

目的重症肌无力(MG)是神经肌肉接头的自身免疫性疾病。乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)作用于乙酰胆碱受体(AChR),通过一系列不同的致病机制导致组织结构改变,AChR密度或功能降低,神经肌肉传递减少,导致严重肌无力。本文初步建立斑点免疫印迹法(DIB)检测AChR-Ab,并对该方法的分析性能及对MG的诊断价值进行评价。方法通过方阵滴定法选择DIB法检测AChR-Ab的最佳实验条件,并用该法检测2018年至2020年来我院就诊的MG患者102例,其他自身免疫病患者108例,并选择100例同期在我院体检的健康人作为研究对象。其中MG患者设为MG组,其他自身免疫病患者为疾病对照组,健康人为正常对照组。同时用ELISA法测定3组的AChR-Ab水平,比较不同方法的分析性能、相关性及诊断价值。结果对测得的结果进行一致性Kappa检验,结果显示DIB法与ELISA法之间高度一致(Kappa值>0.75)。同时经过配对卡方检验,两组差异无统计学意义(P=1.00)。DIB法灵敏度、特异性均低于ELISA法。结论本研究初步建立AChR-Ab检测的DIB法,该方法需进一步优化改进。

免疫组化、Western blot蛋白印迹和免疫荧光染色观察磷酸鞘氨醇受体2大鼠海马中的表达变化

目的观察磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)基因在颞叶癫痫大鼠海马中的表达变化。方法将72只健康雄性Wistar大鼠随机均分为实验组(36例)和对照组(36例)。实验组使用氯化锂—匹罗卡品进行颞叶癫痫诱导制模,成功后持续大发作1h终止待检,对照组以相同剂量生理盐水注射,然后以进行免疫组化、Western blot印迹和免疫荧光染色检测并进行统计学分析。结果免疫组化检测结果显示,两组1d、3d、7d、28d、56d海马S1PR2阳性细胞计数相比有统计学意义(P<0.05);Western blot检测结果显示,两组3d、7d、28d、56d海马S1PR2蛋白表达水平相比有统计学意义(P<0.05);免疫荧光染色检测显示,S1PR2蛋白表达阳性为红色,星形胶质细胞为绿色,细胞核为蓝色。结论颞叶癫痫大鼠海马中S1PR2表达水平显著下降,说明颞叶癫痫发病机制可能与神经元功能、星形胶质细胞增生受到S1PR2影响有关。

HIV-1免疫印迹试验不确定/阴性样本病毒载量检测结果分析

目的分析HIV-1核酸定量试验对HIV-1抗体不确定/阴性结果的诊断价值,为及时诊断HIV感染提供参考依据。方法收集贵州省2个市(州)2021年1月-5月HIV初筛抗体有反应性样本进行免疫印迹试验(WB),WB检测结果为HIV-1抗体不确定/阴性的样本进行VL试验,并对不确定样本随访追踪,随访追踪到WB结果依旧为不确定的样本再次进行VL检测,同时对TMT试剂WB结果呈阴性、VL>5000 copies/mL样本采用麦克莱金HIV抗体确诊检测试剂进行试验,将结果纳入统计分析。结果1440例初筛有反应性样本经WB诊断HIV-1抗体阳性1142例、阴性159例、不确定139例。男性WB抗体阳性确证率高于女性,25岁以下人群阳性确诊率低于其他年龄人群,阴性率显著高于年龄人群。139例不确定样本经VL检测后VL>5000 copies/mL有36例、VL<5000 copies/mL和未检出分别1例和102例,VL值范围为5×10^(5)~1×10^(8)copies/mL、VL>5000 copies/mL样本在50岁及以上男性占比较高。WB不确定样本p24是主要带型。159例WB阴性样本经VL检测有6例(3.8%)VL>5000 copies/mL、未检出153例(96.2%)。139例WB不确定样本追踪到22例,最终10例转阳,6例转阴,6例结合VL检测值综合判定为阴性,VL和WB二者诊断结果具有一致性。结论WB出现抗体不确定/阴性时应立即联合HIV-1核酸定量检测,避免WB检测技术窗口期造成漏诊。

骨髓干细胞移植后Western blot免疫印迹分析鼠抗肌萎缩蛋白表达的变化

目的:Western blot免疫印迹分析骨髓干细胞移植后mdx鼠抗肌萎缩蛋白表达的变化。方法:实验于2004-09/12在中山大学附属第一医院神经科实验室完成。①选取7～8周龄mdx鼠25只,随机数字表法分为骨髓移植4,8,12,16周组、空白对照组,5只/组。另选取4～6周龄C57鼠20只作为供体鼠,10周龄C57鼠5只作为阳性对照组。②各组在移植前均给予照射剂量为7Gy的放疗预处理。放疗完毕后,骨髓移植4,8,12,16周组均进行尾静脉细胞移植,移植细胞数为2×107/只,0.3～0.5mL;空白对照组、阳性对照组尾静脉输入0.3mL磷酸盐缓冲液。③骨髓移植4,8,12,16周组分别于对应时间点处死,取其腓肠肌,制备抗肌萎缩蛋白样品,进行抗肌萎缩蛋白Western blot免疫印迹分析,以GAPDH作为内参。结果:25只7～8周龄mdx鼠、5只10周龄C57鼠全部进入结果分析。骨髓干细胞移植后抗肌萎缩蛋白Western Blot免疫印迹分析结果:空白对照组无抗肌萎缩蛋白的表达;骨髓移植4周组仅可见抗肌萎缩蛋白的微弱表达,dystrophin/GAPDH灰度比值约为0.095±0.267;骨髓移植12周组约为0.218±0.338;随骨髓移植时间的延长抗肌萎缩蛋白表达量逐渐增加,移植后16周的表达量较移植后8周明显增加(0.393±0.385,0.173±0.284;t=6.062,P<0.05),但仍明显低于阳性对照组1.172±0.328(t=3.14,P<0.05)。结论:骨髓干细胞移植mdx鼠后应用WesternBlot免疫印迹分析可于不同时间检测到抗肌萎缩蛋白的表达,且随移植时间延长表达量增多,提示骨髓干细胞移植可长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。

化学发光自显影免疫印迹法(Western Blotting)检测绒山羊皮肤组织中催乳素受体蛋白

采集不同季节绒山羊皮肤组织样品,提取总蛋白,经聚丙烯酰胺凝胶电泳,将电泳结果转移到醋酸纤维薄膜,然后与催乳素抗体结合、辣根过氧化物酶标记二抗结合,后者作用于化学发光底物,暗室中置X-光胶片上自显影数分钟,经显影、定影,得到黑色曝光斑,根据胶片上曝光斑的位置确定出催乳素受体的分子量为87kD。根据不同时期样品黑斑的大小得出各时期催乳素受体表达量与绒毛生长趋势是一致的。

Western印迹分析嗜人按蚊中肠膜蛋白免疫原性

采用Western-blot免疫学方法对嗜人按蚊中肠粗蛋白和膜蛋白(即纯化后的粗蛋白)分子量及免疫原性进行分析.结果,经SDS-PAGE电泳,嗜人按蚊中肠粗蛋白显示8条主带,分子量范围在(66 200～15 850Da);而膜蛋白显示4条主带,分子量范围在(66 200～35 480Da).利用中肠粗蛋白免疫小鼠所获得的抗血清,可特异性识别粗蛋白中的3个条带;而特异性识别膜蛋白的仅1条,分子量为38.9 kDa.可见,利用蔗糖不连续梯度离心可获得膜蛋白,该蛋白含有与抗蚊中肠粗蛋白抗体相结合的膜蛋白表面抗原,这对今后制备嗜人按蚊中肠单克隆抗体具有参考价值.

用免疫印迹法(Western blot)鉴定汉坦病毒的结构蛋白

自1976年分离出朝鲜出血热(KHF)病毒以来,肾综合征出血热(HFRS)病毒的研究取得了很大进展。经病毒形态、组成及理化性状的研究,已确认其属于布尼亚病毒科的一个新成员。

基于免疫蛋白质组学的单增李斯特菌强免疫原性蛋白挖掘

该研究采用高毒力持留基因型单增李斯特菌819-2菌株全菌蛋白免疫SPF级Balb/C小鼠制备抗血清,利用免疫蛋白质组学对菌株胞外蛋白质组进行分析,旨在挖掘筛选单增李斯特菌强免疫原性蛋白作为特异性抗体制备的候选抗原。超声法提取819-2菌株全菌蛋白免疫SPF级Balb/C小鼠制备抗血清,四次免疫后经间接ELISA测定效价达1:512000。脱氧胆酸钠(DOC)-10%(m/V)TCA沉淀法提取单增李斯特菌819-2菌株胞外蛋白,利用免疫蛋白质组学和LC-MS/MS技术挖掘并鉴定具有强免疫反应的蛋白点,结果表明双向电泳图谱成功获得85个蛋白点,并成功鉴定了P60、InlC、MltG、Enolase和假定蛋白YxeA family protein等5个强免疫原性蛋白,研究结果为基于强免疫原性蛋白制备特异性抗体用于食品及其加工环境中单增李斯特菌富集及快速检测技术研制提供了数据基础。

变性梅毒重组抗原免疫印迹技术的建立及其在鉴别梅毒血清学假阳性实验的应用

目的为了评估临床梅毒抗体筛查中出现假阳性实验结果的真实性,建立了变性梅毒重组抗原免疫印迹技术,并应用于对临床非高危人群梅毒抗体筛查阳性血清进行验证确认,分析出现假阳性的可能性。方法采用梅毒TP47,TP45,TP17和TP15重组抗原,将变性后的抗原与非变性的抗原配对包被在硝酸纤维膜载体上,建立梅毒免疫印迹抗体谱检测方法。收集临床经电化学发光免疫分析仪及配套试剂检测的梅毒螺旋体抗体假阳性的非性病高危人群门诊和住院患者血清样本56例、临床确认梅毒患者血清样本25例和健康体检人员样本30例进行方法学验证。并用该方法对1例特殊的“梅毒患者”进行了鉴别。结果根据建立的变性与非变性抗原配对梅毒免疫印迹抗体谱检测结果判定模式,56例临床梅毒螺旋体抗体筛查假阳性样本,对四种变性重组抗原均不发生反应,无阳性条带。但是对二种以上非变性抗原发生弱阳性反应,出现阳性条带;25例梅毒患者对照样本,对四种非变性和变性重组抗原均有反应,出现强阳性条带;30例健康体检人员样本,对四种非变性和变性重组抗原均无反应。梅毒螺旋体特异性抗体阳性特殊“梅毒患者”血清样本,对四种变性重组抗原均为阴性反应,但对四种非变性重组抗原出现阳性反应。患者样本经血清免疫固定电泳分析,结合临床资料诊断为IgGλ型单克隆免疫球蛋白血症。结论变性梅毒重组抗原免疫印迹抗体谱检测,可有效鉴别临床梅毒抗体假阳性样本。但是,对于梅毒患者的确认一定要将检验结果结合患者的流行病学史、临床表现等进行诊断。

蛋白质酪氨酸磷酸化-免疫沉淀及Western印迹两种方法的比较

为了深入了解在细胞信息传递中蛋白质酪氨酸磷酸化研究的较佳方法，采用免疫沉淀法及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法对电离辐射诱导的小鼠胸腺细胞蛋白质磷酸化进行了比较分析。免疫沉淀结果表明，照射后１７５００、２２０００、２８０００、３２０００、４００００、４３０００及５３０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹结果表明，照射后２８０００、３２０００蛋白分子发生酪氨酸磷酸化。提示在蛋白质酪氨酸磷酸化的研究中，免疫沉淀法优于Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法。

丙型肝炎病毒抗体化学发光免疫分析法≥95%阳性预测值最佳吸光度/临界值建立方法学和重要性探讨

目的确定丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)抗体阳性预测值≥95%的最佳吸光度/临界值(signal-to-cutoff,S/CO),确定首都医科大学附属北京地坛医院实验室医学决定水平,为探索不同系统丙型肝炎病毒抗体检测试剂95%阳性置信区间建立方法学。方法收集2021年7月至2022年2月门诊及住院患者进行化学发光免疫分析法(chemiluminescence analysis,CLIA)初筛检测同时进行HCV RNA检测的血浆样本共282例,其中抗体初筛有反应性(S/CO≥1)样本252例,阴性样本30例,进行重组免疫印记试验(recombinant immunoblot assay,RIBA)并查阅其HCV RNA检测结果,通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线得到预测本实验室阳性预测值≥95%时HCV感染的抗体S/CO值。结果初筛为阴性的30例样本双重确证试验结果均为阴性;排除16例HCV感染史不明确的样本,丙型肝炎病毒抗体S/CO≥1的236例样本经双重确证试验得到真阳性样本188例,阴性样本48例,经ROC曲线分析,本实验室阳性预测值≥95%时,本实验室抗体S/CO值为7.83,灵敏度为93.09%,特异度为95.83%,曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.98(P<0.0001)。结论为临床提供本实验室阳性预测值≥95%时HCV感染抗体的S/CO值以协助临床诊疗。

2018-2022年厦门市某三甲医院人类免疫缺陷病毒抗体确认试验结果调研

目的了解2018-2022年厦门市某三甲医院人类免疫缺陷病毒(HIV)抗体筛查试验阳性患者的确认试验结果和相关资料,为临床制定有效防控措施提供参考依据。方法回顾性分析2018-2022年医院就诊人群的HIV抗体筛查试验结果及经过厦门市疾病控制中心(CDC)免疫印迹法(WB)确认HIV抗体阳性患者的检验结果和临床资料。统计HIV筛查试验和确认试验结果,统计HIV抗体阳性样本的人群分布和科室分布、WB条带分布及HIV-1抗体条带模式。结果1323例需送确认试验患者中882例送检,确认HIV抗体阴性339例,阳性466例(465例经WB检测阳性,1例经核酸RNA检测阳性),不确定结果77例中随访确认5例阳性;未送检的441例患者中,既往已确认HIV抗体阳性82例。最终可追踪到的HIV抗体阳性患者共553例,阳性率41.80%。首次确认试验阳性的466例患者中,男女占比差异有统计学意义(P<0.05),不同年龄占比差异有统计学意义(P<0.05);394例患者的首诊科室为内科相关科室,72例为外科相关科室。465例经WB检测阳性样本共检出9条HIV-1抗体条带,1条HIV-2抗体条带;检出率最高的是包膜蛋白抗体gp160(100.00%)、gp120(100.00%)和gp41(99.78%),HIV-2包膜蛋白抗体条带gp36检出12例(2.58%)。465例经WB检测阳性样本共检出21种HIV-1抗体条带模式,其中3种模式含有HIV-2包膜蛋白抗体条带gp36;最常见的3种HIV-1抗体条带模式分别为HIV-1抗体全条带(148例)、缺失HIV-1抗体条带p55(134例)及缺失HIV-1抗体条带p55和p17(102例),3种模式合计占比82.58%,其他条带模式较少见。结论HIV抗体确认试验阳性率较高,阳性患者首诊科室以内科为主。医疗机构应重视HIV筛查,尽量避免漏诊、误诊,并加强临床诊疗过程中有创医疗处置措施时的职业防护,减少职业暴露。

传统蛋白免疫印迹技术常见异常结果及影响因素探究

蛋白免疫印迹技术(western blotting,WB)是检测蛋白质经济、有效的方法,已广泛应用于分子相关的领域,但其影响因素多、操作复杂,常出现异常结果。本研究使用传统蛋白免疫印迹技术法检测(Sprague-Damley,SD)大鼠肝脏、脾脏组织某些蛋白质的表达,分析探讨常见异常结果及处理方法,为实验室和其他实验者提供参考。

免疫印迹法检测过敏原用于过敏性皮肤病诊断的价值

目的探究免疫印迹法检测过敏原用于过敏性皮肤病诊断的价值。方法选择2020年1月至2022年10月来永新县皮肤病防治所就诊的过敏性皮肤病患者120例,入院后均进行免疫印迹法检测,记录吸入性过敏原及食入性过敏原特异度IgE抗体阳性率,并分析不同性别及不同季节的过敏原特异度IgE抗体阳性率情况。结果本研究中吸入性过敏原排名前三的是:尘螨组合(屋尘螨/粉尘螨)31.7%、树花粉(柳树/杨树/榆树)19.2%、猫毛皮屑17.5%;食入性过敏原排名前三的是:牛奶20.0%,鸡蛋白16.7%,鱼虾蟹15.0%;男性与女性患者的尘螨组合(屋尘螨/粉尘螨)、树花粉(柳树/杨树/榆树)、艾蒿的阳性率比较,差异有统计学意义(χ^(2)=5.393、6.009、5.428,P=0.020、0.014、0.020),而两者在猫毛皮屑、狗毛皮屑、普通豚草、蟑螂、真菌混合组及食入性过敏原阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同季节的尘螨组合(屋尘螨/粉尘螨)、艾蒿阳性率比较,差异有统计学意义(χ^(2)=11.130、8.750,P=0.011、0.033),而不同季节的树花粉(柳树/杨树/榆树)、猫毛皮屑、狗毛皮屑、普通豚草、蟑螂、真菌混合组及食入性过敏原阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论免疫印迹法检测可准确查找过敏原,可为过敏性皮肤病的诊断及治疗提供依据,同时不同性别、季节患者的过敏原阳性率存在一定差异,可为患者在日常生活中避免接触相关过敏原提供参考。

间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮的诊断分析

进一步评估并观察间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮的诊断价值与意义。方法 本次研究中将2022年1月~2022年12月期间我院门诊、住院申请双抗链DNA抗体滴度检测的标本共计230例作为研究对象。最终确诊为系统性红斑狼疮患者共计95例,确诊为其他非自身免疫性疾病患者共计135例。分别应用间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测抗核抗体对系统性红斑狼疮进行诊断,对诊断结果进行观察与分析。结果 间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阳性患者共94例,占比为40.90%;间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阴性患者共57例,占比为24.80%;间接免疫荧光法检出阴性/线性免疫印迹法检出阴性患者共42例,占比为18.3%。总符合率方面,阳性结果符合率为69.10%,阴性结果符合率为39.40%。对于诊断为系统性红斑狼疮患者而言,95例患者中,间接免疫荧光法检出阳性/线性免疫印迹法检出阴性患者共17例,间接免疫荧光法检出阴性/线性免疫印迹法检出阳性患者共1例。滴度1:100时,非自身免疫疾病组高于系统性红斑狼疮组,另2组滴度系统性红斑狼疮组高于非自身免疫疾病组;在各个滴度间进行对比,组间差异显著且存在统计学意义。结论 在系统性红斑狼疮临床诊断中,单独进行间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测均存在漏检的可能性,两种方法具有独特优势,不能相互替代。考虑两种方法检测符合率偏低的问题,可以尝试联合同步检测,以面向抗核抗体检测提供可靠结果,配合间接免疫荧光法与线性免疫印迹法检测的联合应用,使临床检测结果更为理想。