Wnt3a在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位

本研究旨在探索Wnt3a在羊驼皮肤中的表达与定位。以不同毛色的成年羊驼为研究对象,应用荧光定量PCR技术分析不同毛色羊驼皮肤Wnt3a基因的相对表达量,并运用Western blotting及免疫组织化学法对Wnt3a蛋白在不同毛色羊驼皮肤中进行表达和定位研究。结果:荧光定量PCR结果显示棕色羊驼中Wnt3amRNA相对表达量是白色羊驼的2.970 2倍;Western blotting结果表明,羊驼皮肤组织组蛋白提取物中存在相对分子质量约39ku的产物,棕色羊驼皮肤平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示Wnt3a在羊驼皮肤毛囊的根鞘和毛球部呈阳性表达,根据光密度值分析得出Wnt3a在棕色和白色羊驼毛囊中的表达差异显著(P<0.05)。通过以上研究显示Wnt3a可能与羊驼毛色形成具有相关性。

甜高粱蔗糖合酶表达与蔗糖积累的相关分析

以甜高粱为原料生产酒精是一种有潜力的生物能源途径,了解甜高粱蔗糖积累机理对生物能源开发具有重要意义。以两个甜高粱品种为材料,利用Western blotting技术检测高粱叶片和茎秆中蔗糖合酶(sucrose synthase,SS)的表达,分析其与蔗糖积累的相关性。结果表明,甜高粱叶片和茎秆中的SS蛋白质表达量在发育早期(拔节期、抽穗期)较低,发育后期(开花期、灌浆期和腊熟期)明显升高,在开花期最高。同2个普通高粱品种相比,在发育后期2个甜高粱品种叶片和茎秆中SS的表达明显增加,且与茎秆中的蔗糖积累相关,推测这是甜高粱与普通高粱蔗糖含量差异的重要原因。试验结果为选育甜高粱品种和提高茎秆蔗糖含量提供了一条可能的策略。

抗伪狂犬病病毒gC抗体制备及其gC蛋白表达

用纯化的重组蛋白His-gCN813制备抗PRV-gC抗体,并分析伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gC蛋白在真核细胞的表达情况。本研究以提取的病毒基因组为模板,PCR克隆PRV gC全长基因,构建gC真核表达质粒p3xFLAG-gC,在真核细胞中表达gC基因;纯化蛋白His-gCN813制备的抗体,Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测到p3xFLAG-gC转染真核细胞和PRV感染细胞中的gC蛋白。结果表明本试验成功构建了PRVgC基因真核表达系统,获得了特异性抗PRV gC抗体,重组gC真核表达质粒p3xFLAG-gC转染Vero细胞,表达的重组蛋白gC为72 ku,PRV感染Vero细胞,表达的gC蛋白为55、72和94 ku,主要定位在细胞浆,gC蛋白可以作为PRV感染的指示分子,为下一步研究PRV和宿主相互作用及PRV的复制奠定了基础。

青海血蜱不同发育阶段蛋白分析

考虑到不同发育阶段蛋白多肽及抗原特性方面的差异,本实验利用SDS-PAGE和Westernblotting对青海血蜱的卵、幼蜱、若蜱、成蜱的蛋白进行了分析。SDS-PAGE结果显示,卵出现了7条主带,幼蜱出现了16条主带,若蜱出现了14条主带,成蜱出现了12条主带。它们的蛋白多肽在数量、含量和分子量上存在差异,共同带只有4条,但相邻发育阶段之间的共同带较多。用感染羊血清和免疫羊血清作免疫印迹时,感染羊血清在分子量5.6万处有明显的反应带,免疫羊血清在分子量9.7万处有明显的反应带。

家蚕具有CHCH结构域的蛋白家族基因BmCH的原核表达和亚细胞定位

含有CHCH保守结构域的蛋白在不同物种中行使不同的功能。从家蚕蛹cDNA文库筛选获得一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其编码蛋白含有一个CHCH保守结构域,将该基因命名为BmCH(GenBank登录号:DQ443425.1)。该序列开放阅读框大小为435 bp,编码144个氨基酸残基。将成功构建的重组质粒pET-28a(+)-BmCH转化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达BmCH融合蛋白,用亲和层析进行纯化后,将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过Westernblotting检测BmCH在家蚕4个发育时期和5龄幼虫组织中的表达情况与用荧光定量PCR检测BmCH在家蚕不同发育时期及5龄幼虫组织中的转录结果基本一致:该蛋白在卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,其中在5龄幼虫期的表达量最高;该蛋白在5龄幼虫的表皮、精巢、中肠、丝腺和卵巢中有明显表达,在血淋巴、马氏管、脂肪体中的表达量较少,但差异不大,而在气管和头部没有表达。利用抗体的免疫荧光标记对BmCH在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到该蛋白主要分布在细胞质中。初步推测BmCH可能是家蚕生长发育的必需蛋白,参与多种细胞生命活动的过程。

Nrf2过表达与敲减Hep1-6稳转细胞株的建立

核因子NF-E2相关因子2(Nrf2)是治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的一个重要靶点分子。为了从体外研究小分子通过靶向Nrf2改善NAFLD的分子机制,首先PCR克隆鼠源Nrf2基因至p Lenti6/V5-D-TOPO空载体得到重组载体p Lenti6/V5-Nrf2,通过测序、酶切鉴定正确后,扩繁质粒,制备慢病毒并将其感染Hep1-6肝癌细胞,用稻瘟醇胚素筛选、鉴定获得稳定表达Nrf2的细胞株。同时,用Nrf2干扰质粒构建慢病毒感染Hep1-6肝癌细胞,通过嘌呤霉素筛选、鉴定Nrf2敲减的细胞株。Q-PCR检测结果显示,过表达稳转株(p Lenti6/V5-Nrf2)中Nrf2基因的表达量为对照组(p Lenti6/V5-Lac Z)的4倍,敲减稳转株中Nrf2基因的表达量大幅度降低。Western blotting显示过表达稳转株的Nrf2表达量明显高于对照组,敲减稳转株的Nrf2表达量明显低于对照稳转株,此结果与Q-PCR结果一致。所克隆的Nrf2基因和敲减基因在Hep1-6小鼠肝癌细胞中得到了正确转录和翻译,稳转细胞株构建成功。

PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白p-AKT及p-mTOR在胃癌组织中的表达及意义

目的探讨PI3K/AKT/mTOR信号传导通路在胃腺癌中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用免疫组化及Western blot法检测p-AKT及p-mT OR在胃癌(100例)、癌旁(80例)及正常胃黏膜(100例)组织中的表达,并分析两者表达的相关性及与临床病理特征的关系。结果p-AKT在胃癌、癌旁及正常胃黏膜组织中的阳性率分别为72%、30%、24%,p-mT OR在胃癌、癌旁及正常胃黏膜组织中的阳性率分别为77%、51%、19%,均呈降低趋势,与Western blot结果一致。p-AKT、p-mTOR在胃癌组织中的表达与肿瘤分化程度有关。p-AKT及p-mTOR在胃癌组织中的表达呈正相关。结论 PI3K/AKT/mTOR信号传导通路在胃癌组织中过表达,可能对胃癌的生物学行为和预后的评估起一定作用。

抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体制备及部分特性鉴定

以原核表达系统pGEX-6p-1-N/BL21经IPTG诱导表达的重组PEDV N-GST融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,制备单克隆抗体,用原核表达系统T12-pPROHTa/BL21经IPTG诱导表达的PEDV N蛋白做筛选抗原,通过间接ELISA进行筛选,获得两株抗PEDV N蛋白杂交瘤细胞,命名为2E3、4C6。亚类鉴定为IgG1和IgG2a型,均为к链抗体,染色体数平均为(91±7)对。用制备的单抗与pGEX-6p-1-N/BL21、T12-pPROHTa/BL21诱导表达后的菌体裂解物做Western Blot试验,在不同载体表达的N蛋白处出现明显的特异性条带;通过间接ELISA做病原检测,这两株单抗不与TGEV、PRV和PrV发生交叉反应,而与PEDV显示良好的特异性反应。

Western blot法诊断囊虫病的应用研究

目的：探讨四种猪囊尾蚴（Ｃｙｓｔｉｃｅｒｃｕｓｃｅｌｕｌｏｓａｅ）特异性抗原ｃＣ１、ｃＣ２、ｃＰ１、ｃＨ１（分子量分别为２８ｋＤａ、１８ｋＤａ、１４ｋＤａ、３４ｋＤａ）混合应用诊断人囊虫病的价值。方法：以猪囊尾蚴ｃＤＮＡ表达文库中筛选出的β－半乳糖苷酶－猪囊虫特异性抗原ｃＤＮＡ编码的融合蛋白（ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＦＰ）为抗原，作简化的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ｉｍｐｒｏｖｅｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，ＩＷＢ）分析，检测１０７例囊虫病、４０例华支睾吸虫病、２４例包虫病和３４例健康人血清对融合蛋白的反应。同时应用粗制抗原（ｃｒｕｄｅａｎｔｉ－ｇｅｎ，ＣＡ）进行ＥＬＩＳＡ、ＩＨＡ对比检测。结果：在简化Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测中，ＦＰ被１０７例囊虫病患者血清中９４例（８７．９％）血清所识别，与华支睾吸虫病、包虫病患者及健康人血清无交叉反应，特异性为１００％。以粗制抗原作ＥＬＩＳＡ、ＩＨＡ检测囊虫病人血清中的ＩｇＧ抗体阳性率分别为８４．１％和７４．８％，与华支睾吸虫病患者血清存在交叉反应，假阳性率分别为２．５％、１２．５％；与包虫病患者血清存在交叉反应，假阳性率分别为８．３％、１６．７％；与健康人血清也存在交?

以融合蛋白为抗原的简化Westernblot法诊断囊虫病

目的：为囊虫的诊断提供简便有效的方法。方法：猪囊尾蚴ｃＤＮＡ表达文库中筛选出的β－半乳糖苷糖－猪囊虫ｃＤＮＡ编码的融合蛋白为抗原，进行简化的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果：四个克隆的融合蛋白（ｃＣ１、ｃＣ２、ｃＰ１和ｃＨ１）联合使用，检测１２４例人囊虫病血清中的抗囊尾蚴ＩｇＧ抗体，阳性率达９３．７％，三个克隆的融合蛋白（ｃＣ１、ｃＣ２、和ｃＰ１）联合使用，检测３８例猪囊虫病血清中的相应抗体，阳性率达１００％，均高于各克隆融合蛋白单独使用的阳性率，且与其他寄生虫病血清无交叉反应。结论：以融合蛋白为抗原所进行的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析具有高度灵敏性和特异性，且简便易操作。

DEN诱导大鼠肝纤维化-肝癌过程中pSmad3L和PAI-1蛋白的表达

目的建立二乙基亚硝胺(diethylinitrosamine,DEN)诱导大鼠肝纤维化-肝癌模型,检测肝组织中磷酸化Smad3连接区(linker-phosphorylated Smad3)和纤溶酶原激活物抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)蛋白的表达。方法♂SD大鼠50只随机分为DEN组和正常对照组,DEN组给予0.2%DEN溶液灌胃,每周5次至14周。对照组给予溶媒。分别于4、8、12、16周结束时处死动物。进行肝组织苏木精-伊红(HE)染色和Van Gieson(VG)胶原纤维染色;分别采用免疫组化法和Western blot法检测肝组织中pSmad3L及PAI-1蛋白的表达。结果对照组肝组织结构正常,DEN组4周时,肝细胞点状坏死及炎性细胞浸润;8周时,肝细胞严重脂肪变性、灶性坏死,门管区出现纤维组织增生;12周时,增生的胶原束包绕并分割肝小叶,正常的肝小叶结构被破坏,假小叶形成;到16周结束时,剩余存活大鼠均形成肝癌,肝癌细胞排列成条索状或团块状,异型性明显。免疫组化结果显示,pSmad3L和PAI-1在正常肝组织中几乎无表达,DEN组4周时肝组织中有少量阳性表达,8周和12周表达量逐渐增强,到16周时达到高峰,尤其是在肿瘤边界区域肝组织的pSmad3L和PAI-1表达更强。Westernblot结果显示,pSmad3L和PAI-1表达也逐渐增强,与免疫组化结果基本一致。结论 DEN诱导大鼠肝纤维化-肝癌动态过程中,pSmad3L和PAI-1蛋白的表达逐渐增强,提示其损伤机制可能涉及TGF-β/Smads/PAI-1通路。

前列腺素E_1预处理对缺血/再灌注心肌PKC及HSP70表达的影响

目的探讨前列腺素E1(PGE1)预处理对大鼠缺血/再灌组心肌PKC及HSP70表达的影响。方法 40只大鼠随机分成5组:正常对照组(C组)、缺血/再灌注组(I/R组)和PGE1 14,42,126μg.L-1预处理组。应用Langendorff装置制备大鼠心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)模型,以HE染色制备病理切片观察心肌纤维病理形态学变化,Western blot技术检测心肌细胞内PKC的表达,免疫组织化学法测定HSP70的表达。结果 PKC和HSP70在PGE1预处理组的表达量较I/R组明显增加(P<0.05),且各预处理组间比较差异有统计学意义(P<0.05);各PGE1预处理组大鼠缺血/再灌注损伤心肌纤维形态学变化得到不同程度的改善。结论 PGE1预处理可以改善大鼠缺血/再灌注损伤心肌纤维形态学变化,促进PKC及HSP70的表达,有效减轻离体大鼠心肌缺血/再灌注损伤。

NGF及其受体P75在四氯化碳中毒性大鼠肝组织中表达增强

目的观察四氯化碳中毒时神经生长因子(NGF)及其受体P75在大鼠肝组织的表达变化,探讨NGF在肝纤维化发生机制中的可能作用。方法用四氯化碳致大鼠肝中毒模型,用RT-PCR法和Western blot法,分别检测NGF及其受体P75在大鼠肝组织中的表达。结果与对照组大鼠肝组织中NGFmRNA及其受体P75蛋白表达量比较,造模组24 h显著增高(P<0.01,n=6),造模48 h和72 h迅速回降,但仍显著高于对照组(P<0.05,n=6)。结论在四氯化碳中毒性大鼠的肝组织中,NGF及其受体P75的表达可能与肝纤维化的形成密切相关。

小麦TaBS1转录因子基因的克隆、原核表达及Western blot检测

转录因子在提高植物抗性中起着重要的作用。本实验从小麦中克隆得到一个新的具有DUF822保守域的转录因子基因TaBS1。为进一步研究该转录因子在参与植物胁迫信号调控中的作用以及蛋白本身的结构、功能和活性等,将TaBS1基因构建到原核表达载体pET-28a(+)上。在终浓度为1mmol·L-1IPTG诱导2h的条件下,得到融合蛋白His-TaBS1,并用Western blot确定所表达的蛋白确实为融合蛋白His-TaBS1。

吴茱萸次碱改善溶血性磷脂酰胆碱诱导的内皮细胞缝隙连接细胞间通讯功能障碍

目的探讨吴茱萸次碱(rutaecarpine,Rut)抗溶血性磷脂酰胆碱(LPC)损伤的内皮保护效应及对缝隙连接细胞间通讯功能(GJIC)的调节作用。方法在培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),预先加入不同浓度的Rut(1.0、0.3、0.1μmol·L-1),处理10 min后加入LPC(10 mg·L-1)共同孵育24 h。应用辣椒素受体(TRPV1)竞争性拮抗剂CAPZ(10μmol·L-1)研究TRPV1是否介导Rut的保护效应。荧光定量PCR检测缝隙连接蛋白Cx37、Cx40的mRNA水平,Western blot检测Cx37和Cx40的蛋白水平,划痕负载试验测定GJIC功能。检测内皮细胞活力(MTT法)、活性氧(ROS)水平和细胞培养液中NO水平及单核细胞黏附,以评价内皮细胞损伤程度。结果 LPC明显下调HUVEC中Cx37和Cx40的mRNA和蛋白水平,抑制缝隙连接染料迁移。而Rut可明显恢复Cx37、Cx40的表达,改善GJIC功能,并减轻LPC诱导血管内皮损伤,表现为增加细胞活力和NO水平,抑制ROS生成和单核细胞黏附。预先给予CAPZ可取消这些效应。结论 Rut可抑制LPC诱导的内皮细胞损伤,恢复Cx37和Cx40的表达而改善GJIC,其机制与激活TRPV1有关。

人牙本质涎蛋白的抗体制备和组织表达研究

目的 :制备人牙本质涎蛋白抗体 ,观察其在不同组织的表达情况。方法 :用原核表达并经过初步纯化的人牙本质涎蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗血清并用Westernblot法测定效价和检测牙胚和其它组织的蛋白表达。结果 :抗人牙本质涎蛋白抗血清效价可达 1:10 0 0 0 0 ;Westernblot显示牙本质涎蛋白在人牙胚中有表达 ,其分子量约为Mr6 0× 10 3 左右。结论 :牙本质涎蛋白在人牙胚组织中有表达 ,提示其在牙齿发生、牙本质修复和再矿化中可能起重要作用。

南移养殖仿刺参(Stichopus japonicus Selenka)铁蛋白基因的克隆及表达特征分析

采用cDNA文库、RACE、荧光定量PCR和Western blot技术,克隆了南移养殖仿刺参铁蛋白基因的全长序列,并对其表达特征进行了研究。结果表明,南移养殖仿刺参铁蛋白cDNA全长1222bp,包括187bp的5’UTR;513bp的3’UTR和编码173个氨基酸残基的522bp的开放阅读框。诸如铁结合序列标签和铁调控元件等铁蛋白特征结构基元在南移刺参铁蛋白中也高度保守;养殖环境条件的改变影响了铁蛋白在某些组织的表达水平,南方养殖仿刺参肌肉带铁蛋白表达量近乎北方养殖仿刺参的2倍,而在呼吸树中两者表达水平没有明显差异。Western blot揭示本研究获得的铁蛋白多克隆抗体不仅与重组蛋白起强的特异性反应,而且还特异性识别肌肉中的天然蛋白,该抗体可用于仿刺参铁蛋白功能的后续研究。

肝纤维化肝组织中肾上腺素能受体的表达研究

目的探讨肝纤维化大鼠肝脏组织中交感神经递质受体表达的变化情况。方法应用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠慢性肝纤维化模型。23只Wistar大鼠随机分为正常对照组(N组)和肝纤维化模型组(M组)。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Westernblot方法检测肝脏组织中肾上腺素能受体mRNA及蛋白质的表达情况。结果肝纤维化大鼠肝脏组织中肾上腺素能受体mRNA和蛋白质表达均比正常组明显增加(P<0·01)。结论肝纤维化时,大鼠肝脏组织中肾上腺素能受体α1-AR和β2-AR表达增加,这可能是肝纤维化时交感神经促进肝纤维化发展的作用机制之一。

GABA_A受体亚基在神经病理性痛大鼠DRG神经元的表达

目的:观察神经病理性痛模型大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)神经元上GABAA受体亚基表达的改变。方法:建立坐骨神经压榨性损伤动物模型(CCI),热板实验检测热刺激缩足反射潜伏期(TWL);并取大鼠L4-L6DRG神经元进行膜片钳实验,观测术后DRG神经元GABA介导的内向电流的变化;分别应用Western Blot技术和免疫荧光技术检测术后GABAA受体γ2和α2亚基表达的变化。结果:(1)CCI模型鼠的TWL比正常组明显缩短(P<0.05);(2)膜片钳实验观察到术后14 d CCI术侧DRG神经元GABA介导的内向电流较正常组明显减小(P<0.05),对侧电流较正常组明显增强(P<0.05);(3)Western Blot检测观察到CCI术侧和对侧DRG神经元上GABAA受体γ2亚基的表达量较对照组均明显下调(P<0.05),术侧和对侧磷酸化γ2亚基表达量较对照组明显上调(P<0.05);(4)术侧GABAA受体α2亚基表达量下调(P<0.05),对侧表达量上调(P<0.05)。结论:神经病理性痛时,磷酸化GABAA受体γ2亚基表达的增多以及GABAA受体亚基组合方式的变化,可能参与了痛觉形成的过程。

人胎盘胎儿侧间充质干细胞无血清培养上清对肺脏上皮细胞氧化应激的保护作用

背景:前期研究证实人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有一定的清除活性氧自由基的能力,且本身具有一定的抗氧化酶活性。目的:探究人胎盘胎儿侧间充质干细胞在无血清培养条件下所得上清对氧化应激损伤的肺脏上皮细胞的保护作用及其作用机制。方法:分别使用不同浓度的过氧化氢(200,400,500,600,800μmol/L)对肺脏上皮细胞A549细胞系进行6,12,24 h的氧化刺激,通过CCK-8法对肺脏上皮细胞存活率进行检测,得出存活率为50%时的过氧化氢浓度作为氧化损伤模型的最适条件。用Hochest33258染色及Western Blot对模型有效性进行验证。采用无血清培养基培养胎盘胎儿侧间充质干细胞,收集P3代细胞培养上清将其作用于氧化损伤的肺脏上皮细胞,培养24 h,即上清组。同时设立损伤组(仅进行氧化损伤)和维生素C组(培养基中添加100μmol/L的维生素C)。利用流式细胞术对各组细胞凋亡情况进行检测以及Western Blot检测凋亡相关蛋白及氧化应激经典信号通路Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关蛋白的表达。结果与结论:(1)CCK-8法检测得出,采用600μmol/L的过氧化氢对肺脏上皮细胞进行24 h的氧化刺激,A549细胞存活率为(56.41±3.31)%。Hochest33258染色及Western Blot证实模型的可靠性;(2)流式细胞术结果显示维生素C组和上清组氧化损伤细胞的凋亡率与损伤组细胞相比有不同程度的降低,其中上清组与损伤组相比差异有统计学意义(P<0.05);(3)Western Blot对凋亡相关蛋白的检测显示,与损伤组对比,维生素C组和上清组凋亡促进基因Bax蛋白表达减弱,凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达增强,且差异有统计学意义(P<0.05)。Nrf2-Keap1-ARE信号通路相关蛋白显示与损伤组对比,维生素C组和上清组Nrf2蛋白表达增强,Keap1分子表达减弱且差异有统计学意义(P<0.05);(4)上述结果提示,实验成功构建了肺脏上皮细胞损伤模型,且人胎盘胎儿侧间充质干细胞培养上清具有一定的抗氧化能力,能够起到减弱氧化损伤,抑制细胞凋亡的作用,其作用机制可能与激活Nrf2-Keap1-ARE信号通路有关。