小麦条锈菌效应蛋白Hasp83在条锈菌致病性中的功能分析

【背景】条锈病是小麦上的重大病害,由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f. sp. tritici,Pst)侵染引起。条锈菌是活体营养型寄生真菌,在侵染过程中形成吸器,通过吸器从寄主植物汲取营养。同时,吸器分泌效应蛋白调控寄主免疫,促进侵染过程。【目的】明确条锈菌效应蛋白的功能及其作用机理,为揭示条锈菌的致病机制打下基础。【方法】比较分析条锈菌夏孢子、芽管和吸器转录组,获得在吸器诱导表达的分泌蛋白基因Hasp83,在本氏烟叶片细胞中瞬时表达观察是否能抑制由BAX引起的细胞坏死;利用qRT-PCR分析该基因在条锈菌侵染小麦不同阶段的表达水平。借助荧光假单胞菌Ⅲ型分泌系统和寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)分析Hasp83在条锈菌侵染过程中的功能。利用酵母双杂交系统筛选小麦中与Hasp83互作的蛋白,免疫共沉淀技术进一步在烟草细胞中共表达验证Hasp83及其候选靶标蛋白的互作。【结果】Hasp83开放阅读框全长522 bp,编码173个氨基酸,蛋白N端1—29位氨基酸为信号肽,无保守结构域,在本氏烟叶片细胞中瞬时表达能抑制由BAX引起的细胞坏死。qRT-PCR分析显示,Hasp83在条锈菌侵染时期上调表达;利用细菌Ⅲ型分泌系统在小麦水源11品种中瞬时表达Hasp83能够抑制荧光假单胞菌引起的胼胝质积累,在接种条锈菌无毒性小种CYR23后,瞬时表达Hasp83株系产生的活性氧积累面积和过敏性坏死面积相比对照减少19.35%—38.62%;利用HIGS技术在接种条锈菌毒性小种CYR31的小麦水源11中沉默Hasp83,发现条锈菌的产孢量、菌丝长度、菌丝扩展面积和吸器数目减少,致病力降低。酵母双杂交结果表明,效应蛋白Hasp83与其小麦中候选靶标过敏性坏死诱导蛋白Tahir1互作。免疫共沉淀进一步证明Hasp83及其候选靶标Tahir1存在互作。【结论】条锈菌效应蛋白Hasp83可抑制寄主由非致病细菌和无毒性条锈菌生理小种引起的小麦防卫反应,增强病原菌的致病力。

三唑酮对小麦条锈菌在寄主内发育的影响

小麦幼苗接种小麦条锈菌3d后,三唑酮喷雾施药。电镜观察三唑酮对条锈菌在寄主内发育的影响。观察发现,菌丝和吸器最初的变化是细胞质中脂肪粒和液泡数量的增加,菌丝和吸器的壁与细胞质膜间出现一些电子致密度高的小泡囊,随后壁内层不规则增厚,菌丝顶端细胞壁增厚最为明显;菌丝和吸器最终解体。吸器外间质的宽度明显增宽,其中累积有染色较深的物质。三唑酮对吸器发育具有致畸作用,并抑制隔膜的形成;受侵寄主细胞分泌的胼胝质,可将吸器体完全包围。观察结果表明三唑酮不仅可直接作用于条锈菌,同时也可通过影响寄生而间接作用于该病菌。

小麦对条锈菌入侵反应的超微结构研究

用电镜研究小麦细胞对条锈菌入侵反应发现,在吸器发育过程中,寄主细胞的细胞器,如细胞核、内质网、叶绿体、高尔基体等常与吸器相伴随,在吸器四周的寄主原生质中形成与侵染有关的管状复合体,该结构可直接与吸器外质膜相连接;寄主细胞可向吸器颈部四周分泌和沉积大量的胼胝质,并可将颈部完全包围。经细胞化学染色表明,胼胝质的主要成分为多糖。

小麦条锈菌吸器发育的超微结构研究

根据形态的变化特征,小麦条锈菌吸器发育分为四个阶段,即吸器母细胞的形成、入侵栓的产生、颈部的延伸和吸器体的膨大。电镜观察发现,吸器母细胞壁和隔膜的结构明显不同于胞间菌丝的壁和隔膜。入侵栓由内外层壁组成,它们分别与吸器母细胞壁和第五、第六层相连接。在颈部延伸过程中,颈部始终未能刺破寄主的质膜。成熟的吸器体呈球形或卵球形,并可产生不规则的突起或分枝,吸器中的多核现象较为普遍。

小麦条锈菌夏孢子形成的电镜观察

电镜观察发现,小麦条锈菌胞间菌丝细胞的多核现象极为普遍,但聚集于寄主表皮细胞下的夏孢子产孢细胞均含两个细胞核。在夏孢子形成过程中,产孢细胞一端先经突起而形成孢子芽,随后孢子芽经延伸和产生隔膜,分别先后形成夏孢子原体,柄细胞和夏孢子。随幼龄夏孢子进一步发育,细胞原生质电子致密度增加,大量脂肪粒累积,孢子体表伸出大量的刺突。在夏孢子之间,还可观察到具形状各异内含体的伴胞细胞。

小麦条锈菌与寄主交界面的超微结构和细胞化学

用电镜技术和细胞化学方法研究结果发现,小麦条锈菌吸器颈部和吸器体壁均由两层构成,即染色较深的外层和染色较浅的内层,但是,具邻位羟基多糖物质的分布模式和糖基的种类在颈部壁和吸器体壁并非一致。在颈部处凹陷的寄主细胞质膜紧贴于其外壁,而在吸器体部位,它与吸器体始终保持一定距离。吸器外间质中存在有多糖物质,α-葡萄糖或α-甘露糖,乙酸半乳糖胺,半乳糖等糖基。此外,在吸器外围的寄主原生质中存在有呈管状的复合体。

小麦慢锈品种‘平原50’上条锈菌侵染的超微结构观察初报

用光镜和电镜观察以条中28号小种接种的馒锈品种‘平原50’和感病品种‘铭贤169’的病理组织和超微结构。光镜观察发现两品种在侵入阶段无明显差异。在接种5天后，两品种中的菌落大小，吸器个数上出现较明显差异。与感病品种‘铭贤169’进行电镜比较观察，在慢锈品种‘平原50’中发现如下现象：在吸器外基质（EM）出现染色较深的物质；吸器周围有大量增生的膜复合体（MC）和内质网（ER）；有一吸器的分支出现；有叶绿体向吸器移动的现象。

小麦条锈菌冬孢子发生的组织学和超微结构研究

采用冷冻切片技术、光学显微镜和电子显微镜技术,系统研究了小麦条锈菌冬孢子的个体发生过程和超微结构特征。结果表明,小麦条锈菌冬孢子由排列在冬孢子堆基部的双核产孢细胞产生。在发育初期,产孢细胞一端产生突起形成冬孢子芽,随后冬孢子芽经延伸并形成隔膜,依次分化形成冬孢子原基、柄细胞和冬孢子原体。冬孢子原体经有丝分裂后产生隔膜发育形成双核双细胞冬孢子。成熟的冬孢子表面光滑,具有明显加厚的细胞壁,双核融合,原生质密度增加,富含脂肪粒和糖原类物质。在部分冬孢子堆周围还可观察到莲花状包被结构。

小麦条锈菌胞间菌丝的超微结构和细胞化学研究

本文应用电镜技术和细胞化学方法,对小麦条锈菌寄主胞间菌丝的超微结构进行了研究。观察发现:小麦条锈菌胞间菌丝有两种类型,即具隔膜菌丝和无隔膜菌丝。在胞间菌丝中,多核现象极为普遍。常规染色和细胞化学染色结果表明:胞间菌丝的细胞壁由四层组成,隔膜由三层构成,细胞壁的内层与隔膜的外层相连,细胞壁和隔膜中含有蛋白质和多糖物质。隔膜的发育可分三个阶段,即隔膜突的形成,隔膜壁的延伸和隔膜孔结构的形成。本研究中还观察到胞间菌丝间的融合现象。本文的研究结果表明:小麦条锈菌胞间菌丝的一些特征显然不同于其它锈菌。

小麦条锈菌吸器超微结构和细胞化学的研究

本文应用电镜技术和细胞化学方法,对小麦条锈菌吸器和入侵点的超微结构进行了研究。小麦条锈菌吸器由呈管状的颈部和顶端膨大的吸器体组成,颈部壁和吸器体壁相互连贯,均为两层,并且含有多糖物质。在颈部中段存在有一染色较深的颈环结构。观察发现吸器中的多核现象极为普遍。细胞化学染色结果表明:在吸器外间质内分布有多糖物质;经蛋白消酶解处理后,吸器外间质中可观察到染色较深的纤丝状物质。在入侵点部位,吸器母细胞壁因局部增厚而呈凸镜状,入侵栓壁由内、外两层构成,这两层分别与吸器母细胞壁的第六层和第五层相连接。本研究还观察到同一入侵点产生两个入侵栓的现象。

种衣剂17号包衣对小麦条锈菌发育影响的超微结构研究

本研究采用电镜技术研究了种衣剂17号对小麦条锈菌发育的影响。观察结果表明,该种衣剂引起病菌和寄主细胞内发生了一系列变化。病菌菌丝和吸器内脂肪粒和液泡明显增加;菌丝壁和吸器壁呈不规则加厚;菌丝分枝处无隔膜产生或隔膜畸形;有的吸器母细胞产生的畸形入侵栓,大都不能穿透寄主细胞壁,初生吸器外间质内沉积有染色较深的物质,次生吸器可产生多个不规则分枝,但不能扩张膨大;菌丝外渗的物质可能引起寄主细胞的坏死;大多数受侵寄主细胞可分泌形成较大的胼胝质,有时寄主细胞分泌的物质可将吸器体完全包围起来。上述结果表明,种衣剂17号不仅可直接作用于条锈菌,而且也可通过影响寄主而间接地影响病菌。

外源茉莉酸甲酯诱导小麦抗条锈病的研究

本文探讨了不同浓度茉莉酸甲酯(MeJA)对小麦抗病性的诱导作用,同时电镜观察了不同浓度MeJA对小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)与寄主细胞超微结构的影响。结果表明,2.00 mmol·L^(-1) MeJA对小麦条锈病的诱导抗性效果最好,可达到35.87%,而0.50 mmol·L^(-1)MeJA在小麦条锈菌夏孢子开始萌发4 h时呈显著抑制作用。经外源MeJA处理后,条锈菌的胞间菌丝、吸器母细胞和吸器的发育明显受到抑制,其中侵染位点的叶肉细胞呈抗性症状。因此,MeJA可使小麦幼苗产生诱导抗性从而提高其抗病性。

小麦条锈菌吸器母细胞超微结构的研究

本文利唱电镜技术研究了小麦条锈菌吸器母细胞的超微特征。观察发现,小麦条锈菌吸器母细胞大部位于胞间菌丝的顶部,但也可形成于两菌丝细胞间,同一菌丝细胞上可着生多个吸器母细胞,吸器母细胞的多核现象较为普遍。吸器母细胞壁由6层组成,而其隔膜可分辩为4层。细泡化学染色结果表明隔膜突中含有多糖类物质,吸器母细胞隔膜突的出现和消失与吸器的发育密切相关。本文结果表明小麦条锈菌吸器母细胞的一些超微特征明显不同于其它锈菌。