花生栽培种和野生种Arachissp.30119六倍体杂种的创制与鉴定

【目的】花生野生种包含许多优异的抗病虫基因,是栽培种改良的重要基因资源库,将野生种染色质导入栽培种是花生远缘杂交研究的重要目的。野生种A.sp.30119对多种花生病害具有抗性,研究其与栽培种的杂种后代,为明确A.sp.30119的身份和未来能够利用其优异抗性提供依据。【方法】利用异源四倍体花生栽培品种白突131与二倍体野生种A.sp.30119杂交,通过胚拯救获得种间杂种F1(W1212),但F1不结实。为了揭示W1212不结实的原因并获得可育的后代,先利用根尖细胞有丝分裂中期和花粉母细胞染色体制片,观察其染色体数目和减数分裂染色体联会情况,再利用试管苗染色体加倍方法对W1212进行加倍处理,最终收获4个单粒荚果,将其中一个荚果的种子组织培养成完整植株并命名为Am1212。利用顺序GISH/FISH和SSR标记分析Am1212的染色体组成,并观察调查其表型特征。最后,利用rDNA FISH随机分析8个Am1212的F3代植株的有丝分裂中期染色体数目,评价其染色体遗传稳定性。【结果】白突131与A.sp.30119的杂种一代W1212花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ的染色体平均构型为1Ⅲ+6Ⅱ+15Ⅰ,其染色体不能正常配对,表现为高度不育,染色体加倍处理后W1212下针枝条的花粉育性显著提高。白突131、A.sp.30119和Am1212的顺序GISH/FISH分析结果表明,A.sp.30119可能为A基因组二倍体野生种。Am1212有60条染色体,包含白突131与A.sp.30119的全部染色体,证实其为六倍体杂种后代。但Am1212自交F3代有37.5%的植株发生了染色体数目变异。通过分子标记筛选和表型调查,获得17个特异追踪A.sp.30119的显性和共显性标记,明确了Am1212的遗传特性。【结论】创制了一个新的六倍体花生Am1212,该六倍体整合了野生种染色质,同时,Am1212也拥有了小荚果等不利性状,且染色体遗传稳定性较差,因此,未来育种利用过程中,需要结合精准的染色体鉴定技术,打破不良连锁,获得具有补偿效应且包含有利性状的染色体变异材料。

源于栽培种花生的EST-SSR引物对野生花生扩增的多态性

以花生属86份野生近缘种和3份栽培种为材料,利用从栽培种花生中开发设计的EST-SSR引物,分析其对野生花生扩增的有效性,探讨EST-SSR引物用于花生资源遗传多样性研究的适用性。随机选取235对EST-SSR引物进行筛选,223对EST-SSR引物均扩增出条带,有效性为94.89%,其中能检测到多态性的53对引物在89份资源中共扩增出238条带,包括206条多态性带。每对引物能扩增出1～12多态性带,平均3.89条,多态性指数为0.044～4.040,平均1.173。统计分析结果表明,89份花生种质材料间的平均相似系数为0.685,变异范围为0.442～0.976,在遗传距离为0.408处,分成2大组9小组,栽培种花生被聚在花生区组中,相同区组的材料基本被聚在一起,A.duranensis与栽培种花生(A.hypogaea L.)的关系较近,聚类结果与花生属的植物学分类基本一致。对含油量和基因型数据相关性分析和t检验发现,POCR437-180/170等6对标记可以作为含油量相关分析标记筛选的后备标记。用这6对标记的引物序列搜索cDNA文库和BLAST库,发现引物POCR437序列对应丙二酸单酰-CoA-ACP转酰酶和酰基载体蛋白的编码基因,这2种蛋白质参与脂肪酸的合成。

野生花生抗青枯病种质的发掘及分子鉴定

以花生属5个区组的79份野生花生种质为材料,系统鉴定了野生花生对青枯病的抗性反应,从中发掘高抗青枯病的种质15份,含匍匐区组种质3份、直立区组1份、异形花区组1份、花生区组8份、未命名种质2份,抗病材料频率达到19%,高于栽培种花生资源的抗性频率。通过SSR分析表明,在所获得的抗青枯病野生花生材料中,四倍体野生种A.monticola与栽培种花生的亲缘关系最近,其次为花生区组的二倍体野生种A.duranensis和A.chacoense。根据DNA扩增结果,绘制了抗青枯病种质的指纹图谱,明确了其SSR分子特性。

花生属野生种质的RAPD鉴定

利用RAPD技术 ,对栽培种与花生属野生种的杂交后代进行了分子标记鉴定 ,结果表明 :从 60个随机寡核苷酸引物中筛选出具多态性的引物 2 7个 ,其中一个引物能检测到来自野生种的DNA特异片段。

花生野生资源品质分析及杂交试验

对供试３４份花生野生资源进行了抗病性鉴定，其中部份参试材料作了品质分析及杂交试验．结果表明，花生野生种对三大叶部病害抗性较强；高蛋白质材料较多，也有高油份材料；花生区组二倍体野生种正反交其花果率差异较大，杂种Ｆ１经染色体加倍后，地上部超亲杂种优势明显，正反交后代花粉粒可育率相差悬殊；花生不同区组远缘杂交授粉后施用激素的花针率比不施激素的高，施用赤霉素比激动素效果好；适宜的赤霉素施用浓度为８７．５ｐｐｍ。

野生花生Hsp70基因家族的全基因组鉴定及生物信息学分析

热激蛋白70(heat shock protein 70,Hsp70)是细胞应对高温和其它胁迫环境时所产生的一类分子伴侣类型应激蛋白。本研究以Arachis duranensis和Arachis ipansis基因组数据库为基础,利用生物信息学方法对Hsp70基因家族进行鉴定分析。结果表明,A.duranensis含有34个Hsp70基因成员,A.ipansis含有35个Hsp70基因成员,两者的直系同源基因大部分分布于两套染色体相近的位置。Ad Hsp70和Ai Hsp70基因家族根据亚细胞定位结果可分4种类型,各类型的Hsp70基因结构相对保守。根据系统进化分析Hsp70基因家族可分为ClassⅠ(Hsp70)和ClassⅡ(Hsp110)两个亚家族,其中ClassⅠ亚家族进一步分为3个小家族,同时揭示Hsp70基因家族成员产生于单双子叶分化之前。GO分析预测表明,Ad Hsp70和Ai Hsp70基因家族功能类别完全一致,各功能类别数目比例变化相似。本研究结果有助于了解花生属植物Hsp70基因家族功能,以期为深入研究花生逆境生理过程中的分子调控机理提供基础。

利用远缘杂交培育半匍匐密枝型高产花生新品系

花生是我国重要的油料作物。为将野生花生的优异基因导入栽培花生,采用远缘杂交方法,将黑花生(A.hypogaeaL.)与野生花生A.monticola进行杂交,获得一个高产株系。该株系平均单株产量为普通花生的4倍,株型由亲本黑花生的直立、疏枝型转变为半匍匐、密枝型。另外,该株系生育期稍长,花量大,花色深,荚果数量多,单枝有效结果范围大约20~25cm。不同株系间荚果果型差异明显,大部分株系果型与黑花生相似。种皮颜色由粉到紫各不相同。种子大小差异明显。研究认为利用半匍匐密枝株型培育高产花生品系(种)是可行的。

花生种间杂种胚胎发育及内源激素变化

以花生栽培品种豫花15为母本分别与野生种A．correntina和A．macedoi杂交，以栽培品种间杂交组合豫花15×白沙1016为对照，采用石蜡切片技术观察花生杂种胚胎发育进程，酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定花生杂种胚胎内源激素含量，分析胚胎发育进程与胚胎内源激素含量的关系。结果显示，3个杂交组合的下针率无明显差异，表明栽培种与2个野生种杂交不存在受精前障碍；与对照相比，豫花15×A．correntina表现杂交可亲和，其胚胎发育中激素含量的变化与对照组合基本一致；而豫花15×A．macedoi杂交授粉后12d内胚胎发育基本正常，17～27d发育缓慢，之后珠被迅速向内增生抑制了胚的进一步发育并最终败育，在同一时期的杂种胚胎中，3．吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和玉米素核苷＋二氢玉米素核苷（ZR＋DHZR）等促进生长的激素维持在较低的水平，而脱落酸（ABA）含量以及脱落酸与某一促进生长激素或3类促进生长激素之和的比值保持了较高的水平，推测可能是激素代谢的失衡导致种问杂种胚胎的败育。用IAA、激动素（KT）单独或混合处理不亲和组合豫花15×A．macedoi杂交授粉后的果针基部表明，外施促进生长的激素能够明显增加胚珠的长度，一定程度上验证了上述推测。

野生花生全基因组抗病相关LOX基因的生物信息学分析

脂肪氧合酶（lipoxygenases，LOX）是生物体内一种重要的双加氧酶，其在植物发育以及响应生物和非生物胁迫时发挥重要作用。本研究从 Arachis duranensis 和 Arachis ipaёnsis 两个野生花生基因组中各鉴定出18个 LOX 基因，分别命名为 AdLOX1～18和 AiLOX1～18。在 AdLOX5、AdLOX7、AiLOX8和 AiLOX18基因的CDS 序列中发现提前终止翻译的终止密码子，而 AiLOX9基因的 CDS 序列过短，推测这些基因可能是假基因。染色体定位结果显示，AdLOX 和 AiLOX 基因主要分布在2、3、6、8、9和10号染色体上，且其直系同源基因分布在两套染色体相同或相近的位置。通过分析 AdLOX 和 AiLOX 基因与已知功能 LOX 基因的亲缘关系发现，Ad-LOX6、AdLOX9、AdLOX11、AdLOX12、AdLOX17、AiLOX1、AiLOX4、AiLOX6、AiLOX16和 AiLOX17基因可能参与花生的抗病过程，启动子分析结果也支持这一结论。基因选择压力研究表明，AdLOX 和 AiLOX 基因在进化历程中受到纯化选择。

野生花生AdWRKY37基因的克隆及表达分析

花生是我国重要的经济作物,野生花生(Arachis duranensis)有着许多栽培种花生尚缺乏的性状,是栽培种花生品种改良不可缺少的优异种质源或基因源。植物中,WRKY基因与抗病密切相关。本试验鉴定并克隆了野生花生Ad WRKY37基因,并对其基因及蛋白序列进行了生物信息学分析。结果显示,Ad WRKY37含有NBS-LRR结构域;顺式调控元件分析显示,Ad WRKY37启动子含有水杨酸(salicylic acid,SA)和茉莉酸(jasmonic,JA)诱导元件。实时荧光定量PCR结果显示,野生花生Ad WRKY37基因在受到青枯病菌液胁迫诱导后表达量升高,且经过水杨酸与茉莉酸处理后表达量也显著上升。以上结果说明野生花生Ad WRKY37基因可能与青枯病耐受相关。

利用不亲和野生种培育抗青枯病高油酸高产食用型花生新品种

利用抗青枯病不亲和野生种种间杂种06I8B4为母本、以自育高油酸亲本CTWE为父本杂交,后代选择用分子标记辅助与近红外模型进行,青枯病抗性实施自然病地鉴定,由此育成抗青枯病、高油酸、高产、食用型品种花育963和花育668。其适应性广,产量水平不逊于普通油酸高产品种;油酸含量超过80%,油亚比均在24以上;口感佳,适合食品加工;青枯病抗性分别达抗病和中抗水平。

利用SSR技术研究花生属种间亲缘关系

用44对SSR特异引物对花生属不同区组的21份种质进行了分析，获得能稳定揭示花生属种间差异的SSR引物34对。34对引物在21份种质中共检测到190个等位基因变异，每个位点上检测的等位变异数为3～11个，平均为5．59个。21份材料间存在很大的遗传变异，平均遗传距离为0．63，变异范围为0．08～0．95。聚类分析表明，区组间的遗传分化大于区组内的遗传分化，匍匐区组的遗传分化大于其他区组的遗传分化，同一物种不同种质问也存在很大的差异。栽培种花生与花生区组材料的亲缘关系相对较近，与花生属的植物学分类一致，其中A基因组的A．duranensis和A．villosa及B基因组的A．batizocoi与栽培种花生的亲缘关系更近一些。

花生属（ArachisL．）多年生野生种组织培养研究初报

本文通过对多年生野花生顶芽、叶片、下胚轴、带叶腋茎段离体组织培养和再生条件的研究，观察到叶圆片３周后形成淡黄绿色愈伤组织，但未能分化出幼芽，上胚轴逐渐褐化、枯死；顶芽在ＭＳ＋ＢＡ＿２＋ＫＴ＿２＋ＯＡ３＿２＋ＬＨ＿（５００）生长势最强，形成众多丛生芽，频率为９８％；茎段嫩枝在ＭＳ＋ＮＡＡ＿２＋ＢＡ＿１上分化出幼芽．正常幼芽在１／２ＭＳ＋ＮＡＡ＿１上．１０ｄ后长出不定根，并发育成小植株．

花生新品种桂花30的选育

花生新品种桂花30系广西农科院经济作物研究所油料室1988年利用贺粤1号×A.monticola（四倍体野生种）F5代品系作母本，粤油92（栽培种）作父本进行复交，经多年选育而成的花生优良品种。该品种具有优质、高产、果型美观等优良性状，在2000～2002年广西花生品种区域试验中，三年荚果平均产量3711.90kg／hm^2，比对照桂花17（3286．35kg／hm^2）增产425．55kg，增产率12．95％；2007年通过广西农作物品种委员会审定。

花生栽培种与双二倍体野生种杂种（F_2）杂交试验

以花生四大类型栽培种为母本，４个人工合成双二倍体野生种杂种为父本组成１６个杂交组合，结果表明：１６个组合的花果率和针果率变化范围都很大，显示各组合间杂交亲和力有较大的差异。野生种杂交种中以（Ａｒａｃｈｉｓ．ｃａｒｄｅｎａｓｉｉ×Ａｒａｃｈｉｓ．ｂａｔｉｚｏｃｏｉ）Ｆ２为父本与栽培种杂交的亲和力最大；而栽培种类型中以天津豆（普通型）为母本与野生种杂种杂交的亲和力最大；但珍珠豆型与４个野生种杂种之间杂交的亲和力差异最小。１６个组合中有许多授粉花不能形成果针而相互间表现不同差异。果针形成正常荚果有４种败育现象。

野生种花生叶片内超氧物歧化酶及其抗paraquat特性

对几种野生花生和栽培花生叶内的超氧物歧化酶(SOD)特性作了比较研究,发现野生种有较高的SOD木平。当用除莠剂paraquat处理两类花生的叶片时,野生种也表现出较强的耐受力。Paraquat处理导致两类花生叶内SOD水平的下降,但野生种内下降的幅度要比栽培种中小得多。用等电聚焦凝胶电泳分析叶中的SOD同工酶后发现,paraquat主要破坏叶绿体SOD(栽培花生叶内SOD活性的主要成分),而对野生花生叶细胞内所含的细胞质SOD及线粒体SOD却没有明显影响,因而野生种花生的抗paraquat特性不仅由于其SOD水平较高,而且也取决于SOD同工酶亚细胞分布的特点。

花生栽培种与野生种(Arachis oteroi)人工杂交双二倍体的创制和鉴定

花生野生种是改良花生栽培种的重要基因资源。为了利用野生花生的抗性基因,本研究利用花生栽培品种豫花9331与二倍体野生种A.oteroi人工杂交,借助胚拯救和染色体秋水仙素加倍,创制一个双二倍体杂种Am E-4,并利用荧光原位杂交和分子标记技术准确鉴定了该双二倍体。观察结果表明,Am E-4的叶片与豫花9331存在显著差异,而主茎高、侧枝长和总分枝数等性状与豫花9331差异不显著。Am E-4开花期较豫花9331推迟60 d,结实性与荚果发育状况较差,不利于Am E-4的育种利用。同时,开发了57个追踪Am E-4中A.oteroi染色体的显性或共显性SSR标记,为创制和鉴定花生栽培种A.oteroi易位系或渐渗系奠定分子基础。

花生属栽野杂种后代抗青枯病研究

用强致病力青枯病病原菌接种花生栽野杂种后代种子 ,通过测定萎蔫指数和抗病率鉴定青枯病抗性。结果表明 ,花生栽野杂种后代存在抗青枯病新品系 ,2 7个品系的抗病率高于抗病对照协抗青 ,其中 7个高抗品系与抗病对照差异达显著或极显著水平。

利用离体培养克服花生杂交不亲和性的研究

将花生栽培种梧油１号和根茎区组的未定名种Ａ．ｓｐ（９６１８）杂交授粉后的胚和胚珠在不同种类和浓度激素的ＭＳ培养基上进行离体培养。从离休胚的胚养上获得了丛生幼枝。胚珠培养表现有３种：①有些胚珠内的胚长出来；②有些胚珠内的胚表现不同程度的分化生长；③还有一些胚珠变黑坏死。将这些胚解剖出来转移到ＭＳ＋２ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／ＬＢＡ或ＭＳ＋０．５ｍｇ／ＬＢＡ的培养基上也获得了丛生幼枝，再将这些丛生的枝转到ＭＳ＋０．０５ｍｇ／ＬＫＴ＋２ｍｇ／ＬＩＡＡ培养基上生根，获得了杂种植株。

野生种花生钙依赖蛋白激酶基因家族的生物信息学分析

Ca2+是植物中重要的第二信使,几乎介导了植物生长发育的全部反应。钙依赖蛋白激酶(CDPKs)是植物中重要的钙传感蛋白,在植物生命活动中扮演着重要角色。目前2个二倍体野生种花生全基因组序列已经公布,而由2个野生种杂交后形成的异源四倍体栽培种花生的全基因组序列还没有公布,野生种花生CDPKs的生物信息学分析结果可以为栽培种花生CDPKs的研究提供参考。本研究采用生物信息学方法和工具对2个野生种花生CDPKs基因家族的全基因组分布、基因结构、进化和理化性质等进行分析。结果表明:2个野生种花生全基因组均比对到35个CDPKs基因序列,野生种花生与拟南芥CDPKs基因结构类似,蛋白质结构具有典型的蛋白质激酶和EF手型结构域,2个野生种花生与其它物种在进化过程中CDPKs变异较小,可能作为钙传感蛋白在细胞内各个部位和细胞器中行使功能。本研究结果可为栽培种花生的CDPKs结构和功能研究提供参考。