宫内发育迟缓大鼠肾脏Wilms瘤1基因DNA甲基化与蛋白尿关系

目的观察宫内环境对肾脏Wilms瘤1(WT1)基因甲基化状态的影响及其与肾脏功能的关系,探讨宫内环境引发肾脏疾病的可能分子机制。方法采用孕期全程低蛋白饮食法建立宫内发育迟缓(IUGR)大鼠模型,至自然分娩。对照组以孕期常规饲料饲养至自然分娩。12周龄时,比色法测定24h尿蛋白定量,光镜下计数肾小球数目,实时PCR方法检测肾脏WT1基因mRNA水平及甲基转移酶DNMT1、DNMT3a和DNMT3bmRNA水平,MassARRAY定量分析检测WT1基因启动子区DNA甲基化状态。结果①IUGR组新生鼠出生体重显著低于对照组(P<0.0001),直至12周龄时体重仍低于对照组(P=0.043)。②与对照组相比,12周龄时IUGR组大鼠24h尿蛋白定量显著升高(P=0.016);血清胱抑素C水平显著升高(P=0.036),肾小球数目显著下降(P=0.001)。③与对照组相比,12周龄时IUGR组大鼠肾组织WT1基因mRNA的表达显著增高(P=0.047),WT1基因启动子区甲基化水平显著降低(P=0.029),并且其M1段甲基化水平与WT1基因mRNA的表达呈负相关(r=-0.939,P=0.0001),DNMT1和DNMT3bmRNA表达水平也显著下降(P值分别为0.003和0.010)。结论不良的宫内环境可以影响大鼠肾脏WT1基因的甲基化状态,继而导致其异常表达,可能参与了IUGR大鼠成年期蛋白尿的发生。

Wilms瘤1基因在肾小管上皮细胞转分化中的表达及作用

目的探讨Wilms肿瘤1基因(WT1)在肾小管上皮细胞(TEC)向肌成纤维细胞转分化中的可能作用。方法将体外原代培养TEC分别置含IL-1α(10ng/ml)、IL-1α+抗WT1中和抗体(10μg/ml)的DMEM/F12培养基中培养,观察TEC的形态变化及免疫学特征。采用RT-PCR检测各组TEC中WT1及α-SMA的表达。结果经IL-1α掺入培养5d后,体外培养的TEC形态特征趋于成纤维细胞化,细胞拉长、梭形变.失去原有的呈铺路石样的生长方式。电镜下细胞极性丧失,表面微绒毛消失。正常情况下,成年TEC不表达WT1。经IL-1α掺入培养1d后,TEC重新表达WT1,同时伴有α-SMA的表达;3d后WT1表达消失,呈一过性特征,而α-SMA的表达则随时间的延长而逐渐增强。在培养中掺入抗WT1抗体以中和WT1基因产物后,尽管仍给予IL-1α刺激,TEC大都保持原有特征不变,α-SMA及WT1mRNA仅呈微弱表达。结论高浓度IL-1α可导致TEC向肌成纤维细胞的转分化。在TEC的转分化过程中,WT1基因的重新、一过性表达可能起着重要作用。成年TEC重新获得WT1表达,可能是其发生转分化的内在启动机制。体外中和WT1的基因产物可明显抑制TEC的转分化进程,并可能籍此影响肾脏的纤维化发生。

Wilms瘤基因1、B7家族成员H3及自然杀伤细胞表面受体在多发性骨髓瘤和淋巴瘤中的表达及临床意义

目的探讨Wilms瘤基因1(WT1)、B7家族成员H3(B7H3)及自然杀伤(NK)细胞表面受体在多发性骨髓瘤和淋巴瘤中的表达及临床意义。方法选取56例多发性骨髓瘤患者和50例淋巴瘤患者,分别作为骨髓瘤组和淋巴瘤组,采用流式细胞仪检测两组患者NK细胞占有核细胞比例,采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测两组患者WT1、B7H3 mRNA相对表达量以及NK细胞表面受体NKG2D、CD69、程序性死亡受体1(PD-1)mRNA的相对表达量。随访1年,比较不同预后情况多发性骨髓瘤和淋巴瘤患者WT1、B7H3 mRNA相对表达量及NK细胞占有核细胞比例。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,计算曲线下面积(AUC),评估各指标对多发性骨髓瘤患者和淋巴瘤患者预后的预测价值。结果骨髓瘤组患者B7H3 mRNA相对表达量低于淋巴瘤组,PD-1、NKG2D mRNA相对表达量及NK细胞占有核细胞比例均高于淋巴瘤组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。随访结束,56例多发性骨髓瘤患者中,预后不良15例,预后良好41例,预后良好的多发性骨髓瘤患者B7H3 mRNA相对表达量明显低于预后不良患者,差异有统计学意义(P﹤0.01)。B7H3预测多发性骨髓瘤患者预后的AUC为0.748(95%CI:0.605~0.891),cut-off值为3.29,此时的灵敏度为0.867,特异度为0.659。随访结束,淋巴瘤组患者中,预后不良19例,预后良好31例,预后良好淋巴瘤患者B7H3 mRNA相对表达量低于预后不良患者,NK细胞占有核细胞比例高于预后不良患者,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。B7H3、NK细胞占有核细胞比例联合检测预测淋巴瘤患者预后的AUC为0.852(95%CI:0.731~0.973),灵敏度为0.871,特异度为0.737。结论B7H3及NK细胞受体在多发性骨髓瘤和淋巴瘤患者中的表达水平存在差异,但WT1水平的差异不明显,B7H3及NK细胞占有核细胞比例对多发性骨髓瘤及淋巴瘤患者的预后有一定的预测意义。

微小RNA-193a调控Wilms瘤基因1促进小鼠糖尿病肾病足细胞凋亡

目的探讨微小RNA(mi R)-193a对糖尿病肾病(DN)足细胞凋亡的影响及作用机制。方法通过体外高糖培养足细胞和体内小鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)复制DN模型,将细胞或60只小鼠随机分为空白对照组、模型对照组、mi R-193a抑制阴性对照组、mi R-193a抑制组、mi R-193a过表达阴性对照组和mi R-193a过表达组。使用流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、TUNEL、Real-time PCR和Western blotting检测DN小鼠和小鼠足细胞凋亡情况。结果DN小鼠和高糖诱导的小鼠足细胞中Nephrin、Podocin表达减弱,细胞凋亡率显著升高,mi R-193a高表达,小鼠肾脏和足细胞中cleaved-Caspase-3和Bax蛋白水平显著升高,Bcl-2蛋白水平显著下降,而mi R-193a抑制剂(inhibitor)可改善这一过程。DN小鼠和高糖培养的小鼠足细胞中Wilms瘤基因1(WT1)m RNA和蛋白表达水平显著降低,mi R-193a inhibitor干预后WT1蛋白表达显著升高。上调WT1可降低mi R-193a对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响。双荧光素酶报告实验证实了mi R-193a和WT1之间的靶向关系。结论MiR-193a下调WT1的表达,促进DN足细胞凋亡。

Wilms瘤基因1低表达和过表达乳腺癌细胞模型的建立

目的应用RNA干扰(RNAi)和RNA激活(RNAa)技术,分别构建小干扰RNA(siRNA)和双链RNA(dsRNA),建立Wilms瘤基因1(WT1)低表达和过表达的乳腺癌细胞模型。方法以国外学者提供的3条序列(siRNA-516、siRNA-803、siRNA-1029)构建WT1 siRNA干扰表达WT1,以研究已证实可上调WT1表达的序列(dsRNA-319)构建dsRNA过表达WT1,通过脂质体(LipofectamineTM2000)分别将siRNA和dsRNA转入MDA-MB-321和MCF-7细胞。WT1有效siRNA筛选实验分为6组:WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803、WT1 siRNA-1029、阴性对照、脂质体组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后24、48、72 h。WT1 dsRNA的筛选实验分为3组:WT1 dsRNA-319、阴性对照组和空白细胞组;观察转染效率的时间点为转染后48、72、96 h。通过实时定量PCR(qRT-PCR)和Western Blotting筛选作用效果最明显的siRNA和dsRNA。使用单因素方差分析进行统计学分析。结果成功构建WT1siRNA-516、WT1 siRNA-803和WT1 siRNA-1029共3个siRNA,并转染到MDA-MB-231细胞中,转染效率达90%以上。上述3个WT1 siRNA均能够抑制WT1 mRNA和蛋白的表达,以转染后48 h WT1 siRNA-1029的效果最为显著[WT1 siRNA-1029组WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著降低(0.49±0.02比1.00±0.08,P=0.00),其蛋白表达水平也明显降低]。成功将WT1 dsRNA-319转染到MCF-7细胞中,转染效率达90%以上。50μmol/L的WT1 dsRNA-319转染后96 h,MCF-7细胞的WT1过表达最为显著[WT1 dsRNA-319组的WT1 mRNA表达水平与空白细胞组相比显著升高(319.06±14.84比1.00±0.07,P=0.00),其蛋白表达水平也明显升高]。结论成功建立低表达WT1的MDA-MB-231细胞和过表达WT1的MCF-7细胞模型,为后续进一步研究WT1在乳腺癌中的生物学行为奠定了基础。

Wilms瘤基因1表达与急性髓系白血病长期预后关系的Meta分析

目的探讨Wilms瘤基因1（WT1）基因表达水平与急性髓系白血病（AML）长期预后的关系。方法计算机检索PubMed、Science Direct、EBSCO、Web of Science、CNKI、VIP和万方数据库，收集符合纳入标准的研究，检索时限均为从建库至2015年3月，由两位研究者根据纳入与排除标准独立筛选文献、提取资料并评价质量后，采用RevMan5．2软件进行Meta分析。结果共纳入11个研究，合计1497例患者。Meta分析结果显示：wn基因高表达是AML患者总生存率（OS）及无病生存率（DFS）的不利因素[HR=1．34，95％C／1．14～1．58，P〈0．01；HR=1．35，95％C／1．11～1．64，P=0．003]；对于正常核型的AML患者，wT1基因高表达仍是OS的不利因素[HR=1．41，95％C／1．01～1．99，P=0．05]。结论WT1基因表达水平是预测AML长期预后的有效指标。

急性髓细胞白血病儿童Wilms瘤基因1及其剪接异构体的表达及临床意义

目的:探讨急性髓细胞白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)患儿骨髓细胞中Wilms瘤基因1(Wilms tumor gene1,WT1)及其剪接异构体WT1(17AA+)的表达及临床意义。方法:应用实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测112例次AML患儿不同阶段骨髓细胞中WT1和WT1(17AA+)mRNA的相对表达量,计算WT1(17AA+)/WT1的比值,并以同期30例非白血病患儿作为对照。结果:AML初诊组患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量均明显高于非白血病对照组及缓解期患儿(P<0.05)。复发组患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量与初诊组和耐药组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。缓解组患儿的WT1(17AA+)/WT1比值明显低于初诊组、复发组和耐药组(P<0.05)。3例AML患儿的动态监测结果显示,临床耐药或复发患儿的WT1和WT1(17AA+)mRNA相对表达量以及WT1(17AA+)/WT1比值均呈持续高表达,或者表现为一过性下降后的再度上升。结论:WT1及WT1(17AA+)mRNA剪接异构体可能成为判断AML预后及临床治疗疗效的指标。

WT-1 mRNA定量分析在急性白血病移植后微小残留病监测中的意义

目的探讨定量检测Wilms瘤基因1(WT-1)m RNA在急性白血病患者造血干细胞移植后的疗效、预后和预测复发中的价值。方法收集84例经异基因造血干细胞移植的急性白血病患者不同治疗时间的骨髓标本,实时荧光定量聚合酶链反应技术(RQ-PCR)分析WT-1 m RNA表达水平;聚合酶链反应-短串联重复序列法(PCR-STR)分析移植后供体基因嵌合率,并进行统计学分析。结果与AML和ALL治疗前组WT-1表达水平[分别为4.13(0.77,9.26)、0.69(0.16,2.35)]比较,AML和ALL治疗后组[分别为0.51(0.06,0.91)(U=164,P<0.01);0.06(0.02,0.10)(U=315,P<0.01]、缓解组[分别为0(0,0.06)(U=0,P<0.01);0(0,0.03)(U=0,P<0.01)]表达水平均明显下降。与缓解组相比,AML复发组[3.35(2.46,5.63)(U=0,P<0.01)]、ALL复发组[2.46(2.17,3.31)(U=0,P<0.01)]WT-1表达水平均明显上升。15例复发患者,在临床确诊复发前的WT-1水平明显升高。移植患者WT-1水平与供体基因嵌合率呈负相关(r=-0.73,P<0.05)。结论 WT-1m RNA定量分析可用于监测经造血干细胞移植急性白血病患者的微小残留病灶,评估疗效、预后及预测疾病复发风险。

wt1定量联合FCM在急性髓细胞白血病MRD监测中的临床应用

目的探讨在急性髓细胞白血病(AML)中Wilms瘤基因1(wt1)mRNA定量联合多参数流式细胞术(FCM)分析监测微小残留病灶的临床应用。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(qRT-PCR)检测35例AML患者的wt1表达水平;将患者根据不同亚型分组检测;并且对9例缓解和4例复发患者进行随访,检测wt1表达水平。采用FCM分析AML中微小残留病灶(MRD)水平。结果与对照组比较,AML病例组wt1表达水平明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。在初诊的各种AML亚型中,M2亚型wt1表达水平最高,M6亚型wt1表达水平最低。9例随访患者提示在达到完全缓解时wt1表达水平下降,而4例随访复发患者在复发时再次升高。FCM检测MRD在不同阶段异常髓系细胞比例明显不同。联合qRT-PCR和FCM技术对MRD检测的敏感性和特异性大大提高,两者具有一致性;利用ROC曲线对复发病例进行分析得到的监测阈值为3.33%。结论在急性髓细胞白血病中wt1 mRNA定量联合多参数流式细胞术分析可用于监测MRD、评估治疗效果、预后及预测疾病复发风险。

乳腺癌发生过程中ER、PR、HER-2及WT1蛋白表达变化的研究

目的探讨雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)及Wilms瘤基因1(WT1)在乳腺癌发生过程中的表达变化。方法收集2011年1月至2011年12月95例经活检病理组织学检查确诊的乳腺疾病患者(乳腺导管上皮增生22例、乳腺导管上皮不典型增生23例、导管内癌23例及导管内癌微浸润27例),取组织病理切片后采用免疫组化SP法检测ER、PR、HER-2和WT1蛋白的表达水平,分别观察在导管上皮增生、不典型增生、导管内癌和导管内癌微浸润4种乳腺癌不同分期水平中的表达情况。结果ER、PR在各组中的阳性表达率无明显差异;HER-2在乳腺导管上皮增生、导管上皮不典型增生、导管内癌和导管内癌伴微浸润中的阳性表达率分别为0(0/22)、4.3%(1/23)、34.8%(8/23)和51.9%(14/27),其表达逐渐增加(P<0.001);WT1的阳性表达率分别为31.8%(7/22)、60.9%(14/23)、13.0%(3/23)和22.2%(6/27),在不典型增生患者中最高,差异有统计学意义(P=0.002)。在导管内癌的患者中,ER、PR的表达与否(+/﹣)和WT1阳性率呈一定的相关性,ER或PR阳性表达者其WT1阳性率更高(P<0.05)。结论ER、PR表达的逐渐增加可提示乳腺癌的发生发展,而HER-2在乳腺癌的启动中发挥重要作用,WT1不仅发挥了癌基因的功能,同时也可参与肿瘤的侵袭和转移,促进其演进过程。

MDR1、SOX4、WT1在急性髓系白血病中的作用及表达水平

目的探讨多药耐药基因(MDR1)、SOX4、Wilms瘤基因1(WT1)与急性髓系白血病(AML)临床特征及预后的关系。方法选取2020年1月至2021年8月该院收治的149例AML患者作为AML组,72例轻度贫血患者作为对照组,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平。分析MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平与AML临床特征及预后的关系。结果AML组骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。白细胞计数≥40×109/L、有器官浸润、治疗后非完全缓解AML患者骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平均高于白细胞计数<40×109/L、无器官浸润及治疗后完全缓解AML患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。MDR1 mRNA、SOX4 mRNA及WT1 mRNA高表达AML患者总生存率均低于MDR1 mRNA、SOX4 mRNA及WT1 mRNA低表达AML患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗后非完全缓解、MDR1 mRNA高表达、SOX4 mRNA高表达、WT1 mRNA高表达为AML预后不良的危险因素(P<0.05)。结论AML患者骨髓组织中MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平增加,并且与白细胞计数增加、有器官浸润、治疗后非完全缓解及预后不良有关,MDR1 mRNA、SOX4 mRNA、WT1 mRNA表达水平及治疗后非完全缓解对临床预后不良有一定的警示作用。

WTAPP1对肾母细胞瘤细胞增殖、侵袭、迁移及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:探讨长链非编码RNA Wilms瘤1相关蛋白假基因1(Wilms tumor 1associated protein pseudogene 1,WTAPP1)对肾母细胞瘤细胞增殖、侵袭、迁移及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:实时荧光定量PCR法检测48例肾母细胞瘤组织及及其配对的癌旁组织、人肾母细胞瘤细胞(SK-NEP-1)和正常肾上皮细胞(PCS-400-010、PCS-400-011和PCS-400-012)中WTAPP1的相对表达量。分析比较WTAPP1高表达和低表达组患者的临床病理特征及预后。采用慢病毒感染的方法将携带有WTAPP1全基因(过表达WTAPP1)的慢病毒载体或特异性针对WTAPP1基因的shRNA(shWTAPP1)的慢病毒载体分别转入SK-NEP-1细胞。分别采用克隆形成实验和CCK-8法检测SK-NEP-1细胞的增殖能力,细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测SK-NEP-1细胞中Wnt3a、β-catenin、C-myc和Survivin蛋白的相对表达量。结果:癌组织中WTAPP1的相对表达量明显高于癌旁组织(P<0.05)。SK-NEP-1细胞WTAPP1的表达水平明显高于正常肾上皮细胞系(PCS-400-010、PCS-400-011和PCS-400-012细胞)(P<0.05)。WTAPP1表达与肾母细胞瘤临床分期具有相关性(P<0.05),而与患者的年龄、性别、肿瘤直径和是否发生淋巴结转移均无相关性(P均>0.05)。WTAPP1高表达患者的5年生存率明显低于低表达者(P<0.05)。WTAPP1过表达后,SK-NEP-1细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显提高(P均<0.05);而沉默WTAPP1表达后,SK-NEP-1细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力均明显降低(P均<0.05)。WTAPP1过表达后,SK-NEP-1细胞中Wnt3a、β-catenin、C-myc和Survivin蛋白的表达水平均明显上调(P均<0.05);沉默WTAPP1表达后,SK-NEP-1细胞中Wnt3a、β-catenin、C-myc和Survivin蛋白的表达水平均明显下调(P均<0.05)。结论:WTAPP1与肾母细胞瘤临床分期和生存预后有关,其可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。

定量PCR法监测白血病细胞微小残留病

目的：建立实时定量监测白血病细胞WT1基因表达的方法。方法：设计并合成WT1基因的全长引物，筛选引物和定量引物，构建HL60细胞的cDNA文库，从中调取并纯化WT1全长基因，通过HindIII与EcoRI的Y,K酶切，连接构建到克隆载体pUC19中，通过菌落PCR，测序鉴定出阳性克隆pUC19-WT1。按有限稀释法制备标准品质粒pUC19-WT1，绘制WT1基因的扩增曲线，熔解曲线和标准曲线，建立全反式维甲酸诱导HL60细胞分化的模型，实时定量PCR法监测在ATRA处理HL60细胞后WT1基因的表达水平。结果：从HL60细胞的cDNA文库中扩增得到全长WT1基因，并构建到克隆载体pUC19中，菌落PCR筛选出阳性克隆pUC19-WT1，测序与预期相符合。WT1基因扩增的熔解曲线显示，Tm值为84，WT1的扩增，标准曲线显示，扩增效率为96％，1K值为O．98。通过实时定量PCIK监测ATRA诱导HL60细胞2天后，WT1基因表达水平显著下调。结论：成功建立了实时定量PCIK监测白血病细胞中WT1基因表达的方法，为白血病以及微小残留病的临床监测奠定基础。