基于网络药理学和分子对接技术的疏风活络丸治疗类风湿性关节炎的机制研究

目的:基于网络药理学和分子模拟对接技术,探究疏风活络丸治疗类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)的活性成分和作用机制。方法:通过TCMSP和PubChem数据库检索疏风活络丸的活性成分和作用靶点,采用GeneCards和DisGeNET数据库检索治疗RA的基因位点,二者取交集获得共有靶点,并经Cytoscape软件可视化,通过网络拓扑算法获得核心化合物和核心靶点;通过STRING平台构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,从而获取重要靶点进行GO和KEGG富集分析;对核心靶点和核心化合物进行分子对接验证。结果:筛选出疏风活络丸的主要活性化合物158个,包括槲皮素、熊果酸、木犀草素等49个核心化合物;筛选出疏风活络丸治疗RA的靶点248个,其中重要靶点84个;GO功能富集和KEGG通路富集分析显示,疏风活络丸主要对机体炎症反应、免疫反应、细胞增殖、凋亡等生物过程进行调控,且主要通过调控肿瘤坏死因子信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、NOD样受体信号通路等发挥治疗作用;分子对接结果显示,疏风活络丸中3个核心化合物(quercetin、ursolic acid、luteolin)与3个核心靶点(IL-6、MAPK14、GSK3B)具有较强的亲和力。结论:疏风活络丸中的槲皮素、熊果酸、木犀草等主要活性成分可能通过MAPK14、GSK3B和IL-6等核心靶点调控机体多条信号通路,发挥对RA的治疗作用。

GC-MS法测定疏风活络丸中伪麻黄碱、麻黄碱、士的宁和马钱子碱的含量

目的:建立疏风活络丸中伪麻黄碱、麻黄碱、士的宁和马钱子碱含量的GC-MS测定方法。方法:采用Variancp-sil 8 CB Low bleed/MS毛细管柱(30m×250μm,0.25μm)分离,升温程序:起始温度50℃,保持1min,以25℃/min升至135℃,保持6min,以30℃/min升至300℃,保持22min。进样口温度为280℃;载气为He,恒流方式,柱流量为1mL/min,不分流进样1μL。MS采用EI离子源,离子源温度230℃;电子能量70 eV,传输管温度300℃,全扫描方式采集定性,质量范围40～450m/z;伪麻黄碱、麻黄碱采用总离子定量,士的宁和马钱子碱采用选择离子定量。结果:4种生物碱达到良好分离。方法平均回收率分别为伪麻黄碱97.82%(RSD2.70%)、麻黄碱98.76%(RSD3.23%)、士的宁98.00%(RSD2.18%)和马钱子碱98.19%(RSD1.89%)(n=6)。结论:所建立的方法可靠,能准确测定疏风活络丸中4种生物碱类的含量。

疏风活络丸质量标准研究

目的:提高疏风活络丸的质量标准;方法:采用显微法鉴别虎杖、木瓜、菝葜、甘草和麻黄;薄层色谱法鉴别麻黄和马钱子;HPLC法测定马钱子中马钱子碱和士的宁的含量,色谱条件:以C18柱分离,柱温35℃,乙腈-0.01mol·L-1庚烷磺酸钠与0.02mol·L-1磷酸二氢钾等量混合溶液(用10%磷酸调节pH至2.8)(21∶79)为流动相;检测波长为260nm,流速1.0mL.min-1。结果:定性鉴别方法简单专属;定量分析方法准确可靠,平均回收率马钱子碱为98.50%(RSD=3.53%,n=6),士的宁为103.65%(RSD=3.23%,n=6),中间精密度RSD分别为3.17%和3.14%(n=15),柱间耐用性RSD分别为3.78%和1.43%(n=3)。结论:所建立的标准可操作性强、质量可控。

疏风活络片急性毒性实验研究

目的阐明疏风活络片急性毒性作用的主要组分,以及其他组分对马钱子急性毒性的影响。方法含马钱子的疏风活络片、单纯马钱子以及不含马钱子的疏风活络片分别灌胃染毒昆明小鼠,采用Bliss计算相应的LD50。结果含马钱子的疏风活络片的主要急性毒性表现为抽搐强直性痉挛,与马钱子急性中毒症状相似。含马钱子的疏风活络片的LD50为1253.5 mg/kg,单独马钱子的LD50为489 mg/kg,不含马钱子的疏风活络片LD50>9600 mg/kg。结论马钱子是疏风活络片急性毒性作用的主要成分,疏风活络片复方中其他组分能部分降低马钱子的急性毒性作用。

疏风活络丸治疗类风湿性关节炎的网络药理学分析及实验研究

目的:探索疏风活络丸治疗类风湿性关节炎的可能机制。方法:通过TCMSP及相关文献收集疏风活络丸中的化合物,建立化学成分数据库。使用SwissTargetPrediction和PharmMapper数据库检索其作用靶点,并与DisGeNET和GeneCards数据库中的类风湿性关节炎相关靶点进行对比。基于获得的交集靶点构建PPI网络并进行拓扑分析。进行GO和KEGG功能富集分析,并构建“化合物-靶点-通路”网络。小鼠40只,采用随机数字表法分为对照组、阳性对照组(地塞米松1.2896 mg·kg^(-1))、疏风活络丸低剂量组(422.5 mg·kg^(-1))及高剂量组(845 mg·kg^(-1))。连续灌胃给药4 d后,采用醋酸扭体法观察其镇痛作用。1周后,再次连续灌胃给药4 d,采用二甲苯致耳廓肿胀法观察其抗炎作用。测量耳片厚度和质量评价小鼠耳廓肿胀度。HE染色评估耳廓的病理组织学改变。ELISA试剂盒检测血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平。免疫组化染色检测耳组织中IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平。免疫荧光染色检测耳组织中PI3K、AKT及MAPK的表达水平。结果:疏风活络丸中共检索出1352个化学组分,经筛选确定活性组分为184个。疏风活络丸入血成分的作用靶点为1514个,而类风湿性关节炎相关靶点为5211个,共有靶点为858个。PPI网络分析显示,核心靶点为291个,最为核心的包括TNF、CTNNB1、EGFR等。GO和KEGG分析显示,核心靶点主要涉及PI3K-Akt、MAPK、Ras等信号通路。与对照组相比,疏风活络丸低、高剂量对乙酸诱导的内脏疼痛感受均具有显著的抑制作用(P<0.01)。疏风活络丸高剂量显著减轻耳廓肿胀小鼠的肿胀度(P<0.05)。耳廓肿胀小鼠耳组织真皮层增厚紊乱,中性粒细胞聚集,疏风活络丸高剂量减少小鼠右耳中性粒细胞数量,真皮层细胞排列较整齐。耳廓肿胀小鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平未发生变化(P>0.05),疏风活络丸低、高剂量未影响小鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平(P>0.05)。疏风活络丸低、高剂量显著降低小鼠耳组织中升高的IL-1β和IL-6的表达(P<0.05)。疏风活络丸显著降低小鼠耳组织中升高的PI3K、AKT及MAPK的表达(P<0.05)。结论:疏风活络丸可能通过影响PI3K-Akt、MAPK、Ras等信号通路,实现对类风湿性关节炎的治疗作用。体现中药复方通过“多成分-多靶点-多途径”治疗疾病的特点。

反相离子对高效液相色谱法测定疏风活络丸中4种生物碱的含量

目的:建立疏风活络丸中伪麻黄碱、麻黄碱、马钱子碱和士的宁的含量测定方法。方法:采用5%氢氧化钠溶液浸润样品后以三氯甲烷于70℃水浴中回流提取,以反相离子对高效液相色谱法测定,采用C18柱(4.6mm×250mm,5μm)分离,柱温30℃;流动相:A为0.01mol.L-1庚烷磺酸钠与0.01mol.L-1磷酸二氢钾等量混合溶液(用磷酸调pH2.8),B为乙腈,梯度洗脱(0min时,A为81%,B为19%;30min时,A为73%,B为27%);流速1.0mL.min-1,检测波长为206nm。结果:4种生物碱成分色谱行为良好,平均回收率(n=6)分别为伪麻黄碱97.36%(RSD=2.1%),麻黄碱97.22%(RSD=2.5%),马钱子碱98.65%(RSD=1.3%),士的宁97.69%(RSD=1.6%)。结论:所建立的方法简单易行,专属性强,准确性好,可用于疏风活络丸中活性兼毒性生物碱类成分的质量控制。