Expression of a Carrot Antifreeze Protein Gene in Escherichia coli

The recombinant expression vector pET43.1b-AFP, which contains full encoding region of a carrot 36 kD antifreeze protein (AFP) gene was constructed. The recombinant was transformed into expression host carrying T7 RNA polymerase gene (DE3 lysogen) and induced by 1 mmol稬-1 IPTG (isopropyl--D-thiogalactoside) to express 110 kD polypeptide of AFP fusion protein. The analysis of product solubility revealed that pET43.1b-AFP was predominately soluble, and the expressed amount reached the maximum after the IPTG treatment for 3 h.

美洲拟鲽抗冻蛋白基因(afp)导入番茄的研究

将整合在Ｔｉ质粒上的ａｆｐ基因作为供体ＤＮＡ，用花粉管通道和子房注射方法导入番茄品种“中蔬四号”中，对Ｄ１、Ｄ２代进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得杂交带；田间抗寒性试验表明，在春季平均气温低于正常年份４·４℃条件下，转基因组植株生长势优于对照；致死温度也比对照降低２℃．

美洲拟鲽抗冻蛋白基因遗传转化草莓的研究

以草莓品种星都2号和全明星的无菌苗叶盘和叶柄基部为外植体,采用携带美洲拟鲽编码pre、pro和mature3种抗冻蛋白(AFP)基因的双元载体系统的根癌农杆菌进行转化,获得7个Km抗性株系。经PCR扩增及PCR-Southern杂交检测,6个株系呈阳性,结果表明,编码pre、pro和mature的AFP基因分别整合到了星都2号和全明星染色体DNA中,其中获得pre、pro和mature转星都2号株系各1个,转化率分别为1.56%、1.49%和1.67%;mature基因转全明星株系3个,转化率为4.05%。

美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中的表达

本文报告了美洲鲽抗冻蛋白基因的克隆及在E.coli中表达的研究,以质粒P^(CT5)作为抗冻蛋白基因的供体,p^(ORF-2)作为表达载体。用HpaⅡ酶从质粒p^(CT5)上切下抗冻蛋白基因片段,再经Bal 31酶,绿豆核酸酶处理,连接上BglⅡ接头,然后插入到p^(ORF-2)的BglⅡ位点上,借助于p^(ORF-2)上的β-半乳糖苷酶基因的活性,使含正确插入抗冻蛋白基因的克隆呈现出蓝色菌落,共获得4000多个转化子,其中有201个蓝色克隆。对于50个蓝色克隆提取质粒DNA,电泳后发现均大于p^(ORF-2)。用BglⅡ消化后,可以发现有300—1500bpDNA片段,同时确定了抗冻蛋白基因在p^(ORF-2)中的插入方向,对于正确插入的克隆作出部分限制性内切酶图谱,测定出插入的抗冻蛋白基因片段的DNA序列,然后将重组质粒从E.coli MH1000菌株转化到E.coliTK1046中,研究分析表达产物,SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明插入的抗冻蛋白的基因已表达,有明显的融合蛋白带,分子量大于β-半乳糖苷酶、是由大肠杆菌的外膜蛋白F,抗冻蛋白和β-半乳糖苷酶组成。融合蛋白含量占总蛋白的20％左右。

冬鲽鱼抗冻蛋白基因的人工合成

合成适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白(Winter flounder antifreeze protein,Wf-AFP)基因.参照冬鲽鱼抗冻蛋白的氨基酸序列及棉花偏爱的密码子,重新设计适合在棉花中表达的Wf-AFP基因序列;根据此序列设计6条寡核苷酸引物,通过PCR方法将其拼接成完整的基因;克隆到pUCm-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,抽提重组子进行酶切鉴定及序列分析.结果表明合成的Wf-AFP基因序列与设计方案完全相符,通过PCR介导的基因合成方法成功获得了适合在棉花中表达的冬鲽鱼抗冻蛋白基因.