Wip1基因在人脑胶质瘤组织中的表达及其与p53基因突变的相关性研究

背景与目的:野生型p53诱导的磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase1,Wip1)是一种新发现的癌基因,其在多种肿瘤中存在过表达。本研究旨在探讨Wip1基因在脑胶质瘤组织中的表达及其与p53基因突变的相关性。方法:收集52例原发胶质瘤及8例脑外伤或脑出血后行内减压术的正常脑组织标本,采用实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative,RFQ-PCR)法检测脑胶质瘤组织中Wip1mRNA的表达,Western blot法检测Wip1蛋白的表达,DNA直接测序法检测脑胶质瘤组织中p53基因的突变情况。统计学分析不同脑胶质瘤病理分级及p53的突变状态间Wip1的表达水平的差异。结果:52例脑胶质瘤中22例(42.3%)发生p53基因突变。Wip1 mRNA在高级别胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)中的表达水平较低级别胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级)及正常脑组织中的表达要略高,但差异无统计学意义(P<0.05)。Wip1基因在无p53基因突变的胶质瘤组织中的表达水平较p53基因突变组要高,差异有统计学意义(P=0.009)。Wip1在野生型p53的胶质瘤中存在选择性的过表达,Wip1在胶质瘤中的过表达与病理分级无明显相关,而与p53的突变状态有关。结论:Wip1基因在脑胶质瘤中存在选择性地过表达,其过表达与p53基因野生型状态相关,可能是胶质瘤恶性进展中除p53基因突变外的另一关键作用因素。

WIP1基因对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响及其在小鼠不同生长阶段的表达

【目的】探究野生型p53诱导磷酸酶1(WIP1)基因与脂肪细胞增殖和分化的关系,以期为猪优质性状育种提供新基因素材。【方法】利用脂质体转染方法将合成的WIP1基因的3对siRNAs(WIP1-790、WIP1-893和WIP1-1845)和阴性对照NC-siRNA分别转染3T3-L1前脂肪细胞,通过实时荧光定量PCR检测WIP1基因的表达水平,比较不同siRNA的干扰效率。然后利用筛选到的干扰效率最高的siRNA敲减WIP1基因在3T3-L1前脂肪细胞中的表达,通过CCK-8检测siRNA敲减细胞和NC-siRNA细胞不同生长时期(0、12、24、48、72、96和120 h)的增殖情况,并通过实时荧光定量PCR检测上述2种细胞24和48 h的细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和Cyclin D1的表达水平。对干扰效率最高的siRNA和NC-siRNA组3T3-L1前脂肪细胞进行成脂诱导分化,通过油红O染色和甘油三酯定量法评估成脂分化效率,利用实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD1)的表达水平,Western blotting法检测PPARγ蛋白的表达水平;通过实时荧光定量PCR检测WIP1基因在21日龄、8周龄和6月龄小鼠腹股沟皮下脂肪组织和性腺脂肪组织的时空表达情况。【结果】基因干扰试验结果显示,3对siRNAs对WIP1基因的表达均具有极显著的干扰作用(P<0.01),其中WIP1-790的干扰效率最高,达到了70%以上。CCK-8检测结果显示,与NC-siRNA组相比,WIP1-790干扰组细胞的增殖速率在各生长时期均极显著降低(P<0.01),且细胞周期基因Cyclin B1和Cyclin D1的表达量在24和48 h均极显著下调(P<0.01)。成脂诱导分化结果显示,与NC-siRNA组相比,WIP1-790干扰组细胞在成脂分化第8天油红O染色阳性细胞明显减少,脂滴含量极显著降低(P<0.01),甘油三酯含量显著降低(P<0.05);PPARγ、C/EBPα、FABP4、SCD1等标记基因mRNA表达水平均极显著降低(P<0.01),PPARγ蛋白表达水平极显著降低(P<0.01)。WIP1基因在8周龄和6月龄小鼠的腹股沟皮下脂肪组织中的表达量分别显著或极显著高于21日龄小鼠(P<0.05;P<0.01),且在6月龄小鼠的性腺脂肪组织中,WIP1基因的表达量极显著高于21日龄和8周龄的小鼠(P<0.01)。【结论】WIP1基因通过调控Cyclin B1、Cyclin D1和PPARγ等细胞周期和成脂分化相关基因的表达影响3T3-L1细胞的增殖和分化,且参与小鼠脂肪沉积过程,结果可为深入解析WIP1基因调控脂肪发生的分子机制提供参考。

Wip1基因在肿瘤中的研究进展

Wip1基因是与人类多种恶性肿瘤发生、发展相关的原癌基因,在胰腺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、神经母细胞瘤、卵巢透明细胞癌中存在过表达,但其作用机制尚未完全清楚。通过检测恶性肿瘤患者肿瘤组织中Wip1基因的表达情况,将有助于恶性肿瘤患者的治疗和预后评估。

基于CRISPR/Cas9技术的Wip1基因敲除ST细胞的建立

旨在采用CRISPR/Cas9编辑系统获得Wip1基因敲除的猪睾丸(swine testis,ST)细胞,为后续在细胞水平上探究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响奠定基础。本研究将实验室已有的靶向Wip1基因第一外显子的两条sgRNA(sgWip1-1和sgWip1-2)分别连接到pX330-GFP和pX330-RFP载体,然后共转染ST细胞(从80~90日龄的猪胚胎睾丸组织中分离出未成熟的支持细胞)。利用流式细胞仪收集红绿双荧光阳性的ST细胞,以用于单克隆细胞挑选。对得到的30个单克隆细胞进行基因型鉴定,并将PCR产物进行T-A克隆。结果显示,有29个单克隆细胞出现了基因片段敲除,Wip1基因的片段敲除效率为96.7%。其中单等位基因片段敲除的有5个,纯合双等位基因片段敲除的有8个,杂合双等位基因片段敲除的有16个。本研究高效地构建了Wip1基因敲除的ST细胞,不仅为后续研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响提供了细胞模型,也为研究Wip1基因对公猪繁殖性能的影响奠定了基础。

Wip1基因沉默对结肠癌细胞化疗敏感性的影响

目的:观察靶向Wip1基因的特异性siRNA序列对结肠癌细胞Wip1基因的抑制效应,探讨Wip1基因沉默对结肠癌细胞化疗敏感性的影响。方法:将Wip1-811 siRNA转染入Wip1高表达的RKO结肠癌细胞株,采用real-time PCR法检测Wip1 mRNA的表达,采用Western blotting方法检测Wip1蛋白表达,采用MTS方法检测结肠癌细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期。结果:Wip1-811 siRNA明显抑制Wip1的表达。抑制Wip1基因表达后,转染组RKO结肠癌细胞对抗肿瘤药物的敏感性增加,5-氟尿嘧啶处理组RKO结肠癌细胞活力由(89.4±6.6)%降至(74.7±3.9)%(P<0.05),奥沙利铂处理组细胞活力由(77.9±2.4)%降至(66.7±2.9)%(P<0.05)。转染Wip1-811 siRNA后,5-氟尿嘧啶处理组细胞凋亡比例由(7.7±0.5)%升至(12.3±3.2)%(P<0.05);奥沙利铂处理组细胞凋亡比例由(14.7±2.1)%升至(34.0±2.1)%(P<0.05)。结论:沉默Wip1基因表达能增强结肠癌细胞的化疗敏感性。

小鼠Wip1基因的表达及其对受精能力的影响

本研究旨在探讨Wip1基因的表达及其对精子受精能力的影响,为阐明Wip1基因对雄性繁殖的影响提供新的着眼点。选取相同饲养环境、同一遗传背景的8周龄左右的野生型雄鼠,利用实时荧光定量PCR技术检测Wip1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织及雄性生殖器官中的表达情况,利用免疫荧光技术检测Wip1蛋白在睾丸组织及精子细胞中的分布情况。以Wip1敲除型雄鼠为试验组,野生型雄鼠为对照组,利用ELISA试剂盒检测两组小鼠血清中睾酮水平;通过体外受精试验比较两组的2-细胞率及囊胚率。结果显示,Wip1基因mRNA在野生型雄鼠各组织中广泛表达,且在雄性生殖器官中表达量较高,其中睾丸中表达量最高,附睾体、附睾头、附睾尾次之;Wip1蛋白主要定位于睾丸组织中的长形精子细胞及附睾成熟精子细胞的头部。ELISA检测结果发现,与野生型雄鼠相比,Wip1敲除型雄鼠血清内睾酮含量极显著下降(P<0.01)。体外受精结果表明,Wip1敲除后2-细胞率及囊胚率均极显著下降(P<0.01)。结果表明,Wip1基因敲除能够引起雄性小鼠受精能力降低,这可能与Wip1基因在精子发生过程中发挥作用相关。

siRNA沉默Wip1基因对人肝癌HepG2细胞的影响

目的 :研究Wip1对肝癌细胞生物学活性的影响。方法:设计并合成能沉默Wip1基因的siRNA质粒,通过脂质体介导转染肝癌HepG2细胞,并分为实验组和空白对照组。用Western blot和qRT-PCR检测转染后细胞内Wip1基因的表达水平,CCK-8检测HepG2细胞增殖,用划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力的改变。结果:将沉默Wip1基因的质粒导入肝癌HepG2细胞后,与空白对照组相比,Wip1的蛋白和mRNA表达水平明显降低(P<0.05);CCK-8检测结果显示转染后第4天细胞增殖能力较空白对照组降低(P<0.05),转染后第5天细胞增殖能力较空白对照组明显降低(P<0.01);实验组迁移及侵袭细胞数均少于空白对照组(P<0.05)。结论:靶向设计的siRNA能有效降低Wip1蛋白和mRNA的表达水平,抑制HepG2细胞的增殖并降低细胞的迁移及侵袭力。

Wip1基因对动物繁殖及免疫的调节作用

野生型p53诱导的磷酸酶1(wild-type p53-induced phosphatase 1,Wip1)是蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase type 2C,PP2C)家族中的一员,可以靶向调控机体内多种重要的信号分子,如p53、MAPK和Chk1/Chk2等,在动物细胞周期、增殖、分化、凋亡、衰老、自噬及DNA损伤修复等生理过程中发挥重要作用。Wip1基因缺失会使小鼠生殖激素水平失衡,且该基因通过ATM、Wnt、凋亡和炎症等信号通路影响精子生成过程,导致雄性动物繁殖力下降。此外,Wip1基因还可通过动态平衡调节DNA损伤反应和去磷酸化作用来影响卵母细胞和胚胎发育,从而调控雌性动物的生殖。免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统,其与炎症反应和肿瘤发生有着紧密的联系。Wip1基因缺失会使病原体敏感性增强,影响T细胞、B细胞和中性粒细胞迁移及凋亡,进而导致炎症反应。作为原癌基因,Wip1基因通过调控各种信号分子影响DNA损伤修复、细胞周期进程及细胞凋亡等,参与肿瘤发生。因此,Wip1基因在动物繁殖调控和免疫调节中扮演着重要角色。目前,Wip1基因受到越来越多学者的关注,特别是其调控动物疾病发生发展的机制已成为研究热点。本研究主要综述了Wip1基因对动物繁殖及免疫的调节作用,以期为家畜育种、疾病防治及靶向治疗提供新思路。

脑胶质瘤Wip1基因与DNA损伤修复关系的研究

目的研究U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默对DNA核苷酸切除修复酶XPA、XPC的影响。方法体外培养人胶质瘤细胞U251,Wip1(-)组采用携带Wip1基因RNA干扰载体的慢病毒沉默Wip1基因,经实时定量PCR验证。对照组(NC组)采用阴性对照病毒感染。使用替莫唑胺(temozolomide,TMZ)进行干预,将细胞分为NC组、NC+TMZ组、Wip1(-)组和Wip1(-)+TMZ组。CCK-8法检测各组细胞的增殖,实时定量PCR检测细胞XPA、XPC m RNA表达,免疫印迹检测细胞XPA、XPC蛋白表达。结果 TMZ干预后48 h、72 h、96 h、120 h、144 h,Wip1(-)+TMZ组细胞增殖率低于其他3组(P<0.05)。TMZ干预48 h后,NC+TMZ组细胞XPA和XPC m RNA表达远远高于NC组(P<0.05),同时XPA和XPC蛋白表达远远高于NC组(P<0.05)。TMZ干预48 h后,Wip1(-)+TMZ组细胞XPC m RNA和XPA蛋白表达水平明显高于Wip1(-)组(P<0.05)。结论 Wip1基因与U251脑胶质瘤细胞DNA损伤修复有关,可通过调节下游产物XPA与XPC参与细胞核苷酸切除修复过程。

慢病毒介导的RNA干扰沉默Wip1基因对人脑胶质母细胞瘤细胞生长的影响

目的构建人Wip1基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体，有效沉默人胶质瘤U251细胞的Wip1基因并观察其对细胞生长的影响。方法设计并合成3条Wip1基因特异性RNAi靶序列，构建到慢病毒pFU—GW—iRNA载体中。慢病毒包装转染HEK293T细胞，获得病毒上清并测定其滴度；感染U251细胞，实时定量聚合酶链反应（PCR）及Westernblot鉴定RNA干扰效率；筛选出基因沉默效率最高的慢病毒感染U251细胞，CCK-8法检测细胞的增殖，Westernblot检测RNA干扰后的bcl-2蛋白表达。结果PCR扩增和测序表明成功构建Wip1慢病毒干扰载体，病毒载体包装获得的病毒上清滴度在3×10^8～8×10^8TU／ml。可以有效地沉默U251细胞中Wip1基因的表达，构建的RNAi慢病毒载体感染U251细胞后Wip1基因的mRNA表达量同对照组比较分别为36．3％、32．9％、23．8％。稳定Wip1RNA干扰后的U251细胞4d后细胞增殖能力下降35．1％。结论慢病毒介导的RNA干扰可以高效稳定地沉默基因表达，Wip1基因促进了U251细胞的增殖。

野生型p53诱导的磷酸酶1与肿瘤发生发展及耐药关系的研究进展

野生型p53诱导的磷酸酶1(Wip1)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,是PP2C家族成员。Wip1基因是一种原癌基因,可协同其他癌基因及致癌信号通路促进肿瘤形成,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。本文从抑制DNA损伤应答、抑制INK4a/ARF信号通路及调控肿瘤细胞侵袭、转移和凋亡相关蛋白表达等方面阐述Wip1基因促进肿瘤发生发展的机制,指出Wip1基因促进肿瘤发生发展过程涉及的相关信号转导分子,分析Wip1基因在肿瘤细胞化疗耐药、放疗抵抗中的作用。

实时荧光定量PCR检测野生型p53介导蛋白磷酸酶mRNA在非小细胞肺癌中的表达

【目的】荧光染料Ⅰ(SYBR GreenⅠ)是一种较为常用的非探针类定量PCR的方法,其结果具有一定特异性。本研究的目的是建立检测野生型p53介导蛋白磷酸酶(Wip1)mRNA的SYBR GreenⅠ实时定量PCR的方法,了解肺癌组织及其远癌正常肺组织中Wip1的表达水平,研究肺癌组织中Wip1的表达水平与各种临床病理特征之间的关系。【方法】利用相对定量的方法检测44例肺癌及相应远癌正常肺组织中Wip1mRNA相对于β-actin mRNA的表达量,进行相对定量分析。【结果】44例非小细胞肺癌(NSCLC)及相应远癌正常肺组织均有Wip1mRNA的表达,其中17例非小细胞肺癌中Wip1mRNA高表达,占38.6%,两者表达差异有统计学意义(Ratio=2.1644±1.394,P<0.05);分化程度低的肺癌组织中Wip1mRNA表达量显著高于分化程度高者(F=5.08,P=0.013)。【结论】SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法可以成功地检测Wip1基因的表达量。初步检测结果显示Wip1可能是一种肺癌发生发展过程中的致癌因素。