薄型子宫内膜不孕症患者Wnt/β-链蛋白信号通路相关基因水平及临床意义

目的分析薄型子宫内膜不孕症患者Wnt/β-链蛋白信号通路相关基因水平及临床意义。方法选取2020年4月至2021年4月在本院接受治疗的46例薄型子宫内膜不孕症患者作为观察组。同期选择非薄型子宫内膜造成不孕症患者46例作为对照组。采用腹部超声观察两组患者子宫内膜厚度及形态。采用多普勒超声检查子宫螺旋动脉收缩期峰值流速(PSV)、搏动指数(PI)与阻力指数(RI)。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清雌二醇(E2)、孕酮(P)水平和促卵泡成熟激素(FSH)。Western Blot检测内膜组织血管内皮生成分子(VEGF)、白血病抑制因子(LIF)、E-钙粘蛋白、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、β-链蛋白水平。结果观察组子宫内膜厚度明显小于对照组(P<0.05);观察组A型子宫内膜比例明显低于对照组,C型子宫内膜比例明显高于对照组(P<0.05)。观察组患者血清E2、P水平明显低于对照组,FSH水平明显高于对照组(P<0.05)。观察组患者PSV明显低于对照组,PI和RI明显高于对照组(P<0.05)。观察组VEGF、LIF蛋白水平明显低于对照组,E-钙粘蛋白、MMP-9、β-链蛋白水平明显高于对照组(P<0.05)。结论薄型子宫内膜不孕症患者子宫内膜容受性较差,血流量较差,Wnt/β-链蛋白可能参与调节患者子宫内膜的生长发育。

LncRNA DLEU2对宫颈癌细胞生物学行为、miR-21和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨长链非编码RNA(lncRNA)淋巴细胞白血病缺失基因2(DLEU2)对宫颈癌细胞生物学行为的影响,并基于miR-21和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路探讨其作用机制。方法 将宫颈癌HeLa细胞分为对照组、DLEU2干扰组、DLEU2干扰空载组、DLEU2过表达组、DLEU2过表达空载组。除对照组外,给予其他组细胞转染相应的质粒。转染24 h后,检测各组的细胞增殖活性、细胞凋亡情况及凋亡相关蛋白表达水平、细胞周期及细胞周期相关因子的mRNA表达水平、细胞侵袭数量及上皮细胞-间充质转化(EMT)相关蛋白表达水平、miR-21表达水平、Wnt/β-catenin的蛋白及mRNA表达水平。结果 (1)与对照组相比,DLEU2过表达组的细胞增殖活性降低、细胞凋亡率增加、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)蛋白表达水平下调、Bcl-2相关性蛋白X和Caspase-3蛋白表达水平上调(P<0.05)。(2)与对照组相比,DLEU2过表达组的G_(1)期和S期细胞比例降低、G_(2)期细胞比例升高、细胞周期相关因子的mRNA表达水平下调(P<0.05)。(3)与对照组相比,DLEU2过表达组的细胞侵袭数减少,神经型钙黏蛋白表达水平下调,上皮型钙黏蛋白表达水平上调(P<0.05)。(4)与对照组相比,DLEU2过表达组的miR-21表达水平及Wnt3a、β-catenin的mRNA和蛋白表达水平均下调。(5)DLEU2干扰组的上述指标变化均与DLEU2过表达组相反(P<0.05),而两个空载组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 DLEU2可能通过调控miR-21及抑制Wnt/β-catenin信号通路活性,从而影响宫颈癌细胞的存活、死亡、EMT和侵袭等生物学行为。

白头翁皂苷D对人乳腺癌MCF-7细胞中Wnt/β-链蛋白信号通路的影响

目的:研究白头翁皂苷D对人乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制效应及其机制。方法:不同浓度的白头翁皂苷D作用于人乳腺癌MCF-7细胞48 h后,CCK-8法检测细胞生存抑制率;Hoechst法检测细胞核凋亡变化;蛋白质印迹法检测MCF-7细胞内Wnt/β-链蛋白信号蛋白及下游组件蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达情况。结果:CCK-8法检测显示白头翁皂苷D可以抑制MCF-7细胞的增殖能力,细胞的生存抑制率呈药物浓度依赖性;Hoechst染色可见部分细胞核的形态发生改变,产生细胞核碎片,核发白等变化;与对照组比较,随着白头翁皂苷D浓度的增加,MCF-7细胞中β-链蛋白的蛋白表达量呈减少趋势;50 nmol·ml^(-1)的白头翁皂苷D诱导组细胞中Cyclin D1及c-Myc的蛋白表达量也明显减少(P<0.05)。结论:白头翁皂苷D可有效抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖,其机制可能与抑制Wnt/β-链蛋白信号通路的激活,并抑制其下游蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达有关。

基于Wnt/β-链蛋白表达评价丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病患者血管的保护作用

目的:通过观察丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病患者大血管Wnt/β-链蛋白(Wnt/β-catenin)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3β)通路表达,以及对颈动脉内膜中层厚度(IMT)和斑块面积的影响,评价丹蛭降糖胶囊对2型糖尿病患者大血管病变的保护作用。方法:将102例2型糖尿病患者随机分为对照组和治疗组各51人。所有患者给予基础药物(常规口服降糖药物)治疗,治疗组采用基础药物+丹蛭降糖胶囊,疗程均为16周。结果:16周后治疗组总有效率84.31%,优于对照组的64.71%,差异有统计学意义(P<0.05);两组治疗前后比较中医证候积分、FPG、2 h PG、Hb A1c、TC、TG、LDL、HDL、颈动脉IMT及斑块面积水平都有所改善(P<0.05或P<0.01);组间比较,治疗组中医证候积分、2 h PG、Hb A1c、TG及LDL水平下降,具有统计学差异(P<0.05或P<0.01);治疗组IMT改善情况优于对照组(P<0.05),但斑块面积改善情况无统计学意义(P>0.05)。治疗后,治疗组血清β-catenin水平较对照组显著降低(P<0.01),血清GSK-3β水平比对照组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:丹蛭降糖胶囊可以显著缓解2型糖尿病患者临床症状,并在一定程度上改善或逆转颈动脉硬化进程。

Wnt／β-连环链蛋白信号通路与特发性肺纤维化疾病的研究进展

特发性肺纤维化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种常见的肺部弥漫性纤维化疾病，目前它的发病机制尚未完全明确，临床上缺乏有效的治疗手段，死亡率较高。Wnt信号通路存在于大多数真核生物的各种组织细胞中，是一条在生物进化中高度保守的信号通路，参与调控细胞的增殖、分化、迁移和极性的产生等生理活动，在胚胎发育、器官形态、肿瘤以及纤维化疾病的发生进展中发挥了重要作用。近年来研究发现,Wnt／β-catenin信号通路参与了特发性肺纤维化疾病的发生发展。

沉默lncRNA ST7-AS1通过Wnt/β-catenin信号通路对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭影响的实验研究

目的:探讨沉默长链非编码RNA(lncRNA)致癌性抑制基因7反义RNA1(ST7-AS1)通过Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:肝癌细胞系HCCLM3分成Control组、Vector组、ST7-AS1组、sh-NC组、sh-ST7-AS1组和sh-ST7-AS1+Wnt/β-catenin通路激动剂(SKL2001)组。结果:与Control组比较,ST7-AS1组HCCLM3细胞的吸光度(A570)值及N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vemintin)、Wnt1和β-catenin的表达升高,克隆数量和迁移、侵袭数目增多,上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和GSK-3β的表达降低(P<0.05)。Wnt/β-catenin通路激动剂SKL2001可部分逆转沉默ST7-AS1对HCCLM3细胞增殖、迁移、侵袭的影响(P<0.05)。结论:沉默ST7-AS1可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭。

与Wnt/β-连环蛋白信号通路相关的长链非编码RNAs的研究进展

Wnt/β-连环蛋白信号通路调节体内多种生理、病理程序,其表观遗传和转录水平的调控异常会导致心血管系统疾病以及肿瘤等的发生。长链非编码RNA能从表观遗传、转录及转录后等多个水平调节与心脏发育、心血管系统疾病及多种肿瘤相关的基因及信号通路。同时研究证实一些长链非编码RNA能与Wnt/β-连环蛋白信号通路形成调节网络参与调控心血管系统疾病的发生及肿瘤的侵袭、迁移。本综述主要总结了近年来与Wnt/β-连环蛋白信号通路相关的长链非编码RNA的研究进展以及这些长链非编码RNA在心血管系统疾病中的作用。

Pin1与β-链蛋白—Wnt信号途径的致肿瘤机制

β-链蛋白(β-catenin)是Wnt信号途径核心成员。Wnt信号传入细胞核致β-链蛋白磷酸化以后,磷酸化依赖肽酰脯氨酰异构酶(Pin1)特异性地催化β-链蛋白(p)丝/苏氨酰-脯氨酰肽键的顺反异构[反式(trans)到顺式(cis)],结果β-链蛋白结构稳定、保持活性状态。Pin1机制是Wnt信号途径致肿瘤重要新机制,并与途径信号分子基因突变等完全无关。

沉默长链非编码RNA DGCR5对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:研究沉默长链非编码RNA DGCR5对肺腺癌细胞增殖、侵袭、迁移及Wnt/β-catenin信号通路的影响,探讨DGCR5对肺腺癌的可能作用机制。方法:将H1650和A549细胞株分为空白对照组(Blank)、阴性对照组(NC)和siRNA-DGCR5组(si-DGCR5),si-DGCR5组细胞转染siRNA-DGCR5,NC组细胞转染siRNA-NC,Blank组不转染。qRT-PCR测量细胞中DGCR5水平,CCK8检测细胞增殖(OD值),Transwell测定细胞侵袭能力,划痕实验测定细胞迁移能力,Western blot测定各组H1650和A549细胞中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-gsk-3β)蛋白水平。结果:H1650和A549细胞中,与Blank组和NC组相比,si-DGCR5组DGCR5水平、细胞OD值、穿膜细胞数、细胞迁移距离降低(P<0.05),E-cadherin、p-gsk-3β蛋白水平升高(P<0.05),Vimentin、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05);Blank组和NC组DGCR5水平、细胞OD值、穿膜细胞数、细胞迁移距离及细胞E-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-gsk-3β蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:沉默DGCR5可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制上皮间质转化,从而抑制肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。

Wnt信号通路蛋白β-链蛋白和糖原合成酶激酶3β在单眼形觉剥夺性弱视大鼠视皮层的表达变化

目的研究Wnt信号通路蛋白β-链蛋白(β-catenin)和糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)在单眼形觉剥夺性弱视(monocular deprivation amblyopia,MD)大鼠视皮层的表达变化。方法出生后14 d的健康SD大鼠64只,随机分为MD组和正常(normal postnatal,NP)组。MD组行单眼睑缘缝合术,根据剥夺时间又分为单眼剥夺7 d、21 d、45 d、90 d 4个小组,每小组8只;NP组不作任何处理,相应分为7 d、21 d、45 d、90 d 4个小组,每小组8只。行闪光视觉诱发电位检测,确定MD模型建立成功。免疫组织化学染色观察MD组和NP组大鼠视皮层β-catenin和GSK-3β的表达变化,通过图像分析系统测定平均光密度值并进行统计学分析。结果免疫组织化学染色结果显示,与NP组大鼠相比,MD组大鼠各时间点视皮层GSK-3β的表达均明显增高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);且随剥夺时间延长,GSK-3β的表达逐渐增加,MD组内各时间点之间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。MD组各时间点大鼠视皮层β-catenin的表达比NP组均明显降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);且随剥夺时间延长,β-catenin的表达逐渐减少,MD组内各时间点之间两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论 Wnt信号通路蛋白可能参与了视觉发育可塑性的调控和弱视的形成,但其具体作用机制还有待进一步研究。

Wnt/β-catenin信号转导通路与脑缺血后细胞凋亡

脑缺血损伤机制极为复杂,炎症、氧化应激以及凋亡各种损伤因素均与缺血性脑损伤及损伤扩大的过程相关。由于细胞凋亡主要发生在梗死区周围的缺血半暗带区,凋亡神经元的多寡直接决定着神经元坏死数量和梗死区域的面积,因此,细胞凋亡在脑缺血损伤中起着重要作用,及时有效的抗凋亡措施,有望成为缺血性卒中的有效治疗方法。

Wnt信号传导通路与Cadherin/Catenin复合体的关联及其在肿瘤发生中的作用

多项研究结果已证实Wnt信号传导通路与多种人类肿瘤的发生发展有密切关系.Wnt信号传导通路的关键成分β-链接素同时也可作为Cadherin/Catenin复合体的组分,在细胞-细胞间黏附和细胞迁徙中起作用.以β-链接素为中心,Wnt信号传导通路与其他的信号通路相互影响,形成网络.本文将重点介绍Wnt信号传导通路与Cadherin/Catenin复合体间相互影响的分子机制,并对其在肿瘤发生过程中的作用进行综述.

Wnt通路抑制因子Dickkopf-1的表达作用

目的:研究Wnt通路抑制因子Dickkopf-1(DKK-1)的表达作用。方法:将携带p53基因的复制缺陷型腺病毒载体(Adp53)导入到p53完全缺失的人肝癌细胞株Hep3B中,并以Wnt通路的关键因子β-链接蛋白(-βcatenin)的改变为功能指标评价Wnt通路的变化。以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测Wnt通路抑制因子DKK-1表达的调节作用,以流式细胞术检测Adp53的转基因情况和-βcatenin的表达。结果:DKK-1mRNA水平在转染Adp53 20h后即有明显升高32h达最高水平,随后逐渐降低。量效关系研究表明在转染Adp53剂量为0.5,5,50pfu/cell时DKK1mRNA表达均有显著增高,尤以50pfu/cell时表达水平最高。-βcatenin表达水平随着转染时间和转染剂量的增加,阳性细胞百分比强度和平均荧光量强度表达水平逐渐下降。结论:外源性p53能够诱导Wnt通路抑制剂DKK-1的表达,进而产生抑制Wnt通路的作用。

西黄丸对乳腺癌小鼠Wnt/β-catenin通路的调节及化疗增敏作用

目的研究西黄丸对乳腺癌荷瘤小鼠的化疗增敏作用及对Wnt/β-连环蛋白(catenin)通路的调节作用。方法BALB/c小鼠采用右前肢腋下接种MCF-7细胞法建立乳腺癌荷瘤小鼠模型,造模完成后,随机分为乳腺癌模型组、西黄丸组、阿霉素组、西黄丸联合阿霉素组各10只,西黄丸组按照2.16 g/kg灌胃给予西黄丸,1次/d,连续28 d;阿霉素组腹腔注射给予2 mg/kg阿霉素,每3 d给药1次;西黄丸联合阿霉素组同时给予西黄丸及阿霉素。末次给药结束24 h后,测定肿瘤体积,计算肿瘤体积及抑瘤率,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肿瘤组织白细胞介素(IL)-6、IL-2、IL-10及干扰素(IFN)-γ水平,TUNEL法测定肿瘤组织细胞凋亡率,苏木素-伊红(HE)染色进行组织病理学检查,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)测定肿瘤组织β-catenin、原癌基因(c-Myc)及细胞周期蛋白(cyclin)D1 mRNA水平,Western印迹法测定肿瘤组织β-catenin、c-Myc及cyclinD1蛋白表达。结果与乳腺癌模型组比较,西黄丸组、阿霉素组及西黄丸联合阿霉素组肿瘤体积显著缩小,肿瘤组织IL-6、IL-2及IFN-γ水平、肿瘤组织细胞凋亡率显著升高,肿瘤组织β-catenin、c-Myc及cyclinD1 mRNA及蛋白水平、IL-10显著降低(均P<0.05);与西黄丸组及阿霉素组比较,西黄丸联合阿霉素组肿瘤体积显著缩小,抑瘤率、肿瘤组织IL-6、IL-2及IFN-γ水平、肿瘤组织细胞凋亡率显著升高,肿瘤组织β-catenin、c-Myc及cyclinD1 mRNA及蛋白水平、IL-10显著降低(均P<0.05)。结论西黄丸对乳腺癌荷瘤小鼠具有显著的化疗增敏作用,西黄丸联合阿霉素能够显著抑制乳腺癌荷瘤小鼠肿瘤增长,调节肿瘤组织免疫因子水平,其机制可能与调节Wnt/β-catenin通路有关。

氟对大鼠成骨细胞Wnt3α、β-链蛋白mRNA和蛋白表达的影响

目的观察氟中毒大鼠成骨细胞Wnt3α、β-链蛋白（catenin）mRNA和蛋白表达，探讨氟骨症发生与Wnt通路的关系。方法健康SD大鼠36只，体质量100—120g，按体质量将大鼠随机分为3组，每组12只。对照组大鼠饮用自来水（含氟量〈1mg／L），低氟组、高氟组大鼠分别饮用含5、50mg／L氟化钠的自来水。大鼠饲养8个月，建立慢性氟中毒模型。饲养期间检查大鼠氟斑牙发生情况，股动脉放血处死大鼠前收集大鼠24h尿样，处死后取股骨组织。采用氟离子选择电极法测定尿氟和骨氟含量；固相夹心酶联免疫吸附（ELISA）法测定血清骨碱性磷酸酶（BALP）和抗酒石酸酸性磷酸酶一5b（TRACP一5b）含量；光镜下观察骨组织的形态学变化，测量骨皮质厚度、骨小梁宽度及密度变化；原位杂交技术和免疫组化方法检测成骨细胞Wnt3α、β-cateninmRNA和蛋白表达。结果大鼠氟斑牙检出率低氟组为66．7％（8／12），高氟组为91．7％（11／12），对照组为0．O％（0／12），组间比较差异有统计学意义（x。：21．6，P〈0．05）。尿氟和骨氟组问比较差异有统计学意义（F=36．57、467．02，P均〈0．05），其中低氟组[（2．06±0．64）mg／L、（632．33±123．21）mg／kS]和高氟组[（7．69±1．96）mg／L、（1088．75±156．16）mg／kg]高于对照组[（1．26±0．17）mg／L、（305．58±91．26）mg／kg，P均〈0．05]，高氟组高于低氟组（P均〈0．05）。血清BALP和TRACP-5b组间比较差异有统计学意义（F=89．57、7．68，P均〈0．05）。其中低氟组[（31．47±5．30）U／L]和高氟组[（54．61±2．27）U／L]，血清BALP明显高于对照组[（16．24±1．57）U／L，P均〈0．05]，高氟组高于低氟组（P〈0．05）；血清TRACP-5b，低氟组[（3．45±1．85）U／L）明显高于对照组[（1．264±0．23）U／L]和高氟组[（2．744±1．8）]U／L，P均〈0．05]。光镜下，高氟组和低氟组大鼠股骨骨皮质较对照组增厚，骨小梁增宽、排列紧密。原位杂交和免疫组化显示，近骨小梁表面的成骨细胞细胞质和细胞核呈棕黄色阳性着色。图像分析显示，Wnt3a、B—cateninmRNA和蛋白表达组间比较差异有统计学意义（F值分别为12．47、5．96，10．07、53．82，P均〈0．05）。其中低氟组（132．87±5．72、132．574-9．56，137．50±4．32、140．85±3．54）和高氟组（135．60±6．64、137．87±9．16，142．654±11．84、152．524±4．64）均高于对照组（119．864±5．04、120．584±7．84，124．01±2．63、126．75±4．65，P均〈0．05）；除β—catenin蛋白表达高氟组明显高于低氟组（P〈0．05）外，其他两组间比较差异无统计学意义（P均〉0．05）。相关分析显示，Wnt3amRNA与β—cateninmRNA表达、Wnt3a蛋白与β—catenin蛋白表达，二者之间都具有相关性（r值分别为0．731、0．658，P均〈0．05）。结论过量氟引起的大鼠骨组织的病变可能与Wnt3a、β—cateninmRNA和蛋白在成骨细胞的表达增高有关。慢性氟中毒时，氟通过刺激Wnt经典信号通路中Wnt3a、β一catenin的过表达，使成骨作用增强，从而引起骨骼的病变而发生氟骨症。

淫羊藿苷通过Wnt/β-catenin信号通路抑制淀粉样蛋白Aβ_(25-35)所诱导的神经毒性

目的研究淫羊藿苷(icariin)对β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)所致的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株(PC12细胞)神经毒性的抑制作用和潜在机制。方法将PC12细胞分为正常对照组、Aβ25-35损伤组、淫羊藿苷与Aβ25-35共同给药组、淫羊藿苷单独给药组,然后考察淫羊藿苷对PC12细胞损伤的保护作用,以及淫羊藿苷对Wnt/β-catenin信号通路的调节作用。结果淫羊藿苷可以显著的抑制Aβ25-35所诱导的PC12细胞神经毒性,提高细胞存活率,此外其还可以降低凋亡相关蛋白caspase-3和PARP的激活。机制研究发现,淫羊藿苷可以激活Wnt/β-catenin信号通路中的关键蛋白β-catenin的活性,抑制其磷酸化,并促进该蛋白向细胞核中的转运。此外,淫羊藿苷还可以通过调节不同的磷酸化位点来抑制GSK-3β信号蛋白的活化。结论淫羊藿苷可显著抑制Aβ25-35所致的PC12细胞的毒性作用,其潜在机制可能是通过激活Wnt/β-catenin信号通路来实现的。

lncRNA ANCR调节骨质疏松大鼠脂肪源性干细胞分化成骨细胞及对Wnt信号通路的作用机制

目的探讨lncRNA ANCR调节骨质疏松(osteoporosis,OP)大鼠脂肪源性干细胞分化成骨细胞及对Wnt信号通路的作用机制。方法将lncRNA ANCR siRNA慢病毒载体及慢病毒空载体分别转染至脂肪源性干细胞,分为siRNA组、空载体组、干细胞组。分别通过碱性磷酸酶染色观察ALP染色效果、Western blot法检测Wnt/β-catenin蛋白水平、茜素红染色实验检测成骨染色效果、免疫组化法检测Wnt/β-catenin信号阳性表达的差异性。结果与空载体组、干细胞组相比较,siRNA组细胞中ALP染色显著加深(P均<0.05),成骨染色更为显著(P均<0.05);与空载体组,干细胞组相比较,siRNA组细胞Wnt/β-catenin蛋白表达显著上升(P均<0.05),Wnt/β-catenin阳性数显著升高(P均<0.05);空载体组与干细胞组比较,细胞中Wnt/β-catenin蛋白、ALP表达水平、Wnt/β-catenin阳性数相近,无显著差异(P>0.05)。结论lncRNA ANCR的表达水平与骨质疏松大鼠体内脂肪源性干细胞的分化存在显著相关性,下调lncRNA ANCR能够促进脂肪源性干细胞向成骨细胞分化,其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin的表达有关。

长链非编码RNA Crnde通过调节Wnt/β-连环蛋白信号通路影响小鼠成骨细胞增殖的研究

目的观察长链非编码RNA Crnde通过调节Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对小鼠成骨细胞增殖的影响。方法培养MC3T3-E1成骨细胞,随后诱导分化3周,实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Crnde表达,应用CRISPR-Cas9方法构建Crnde基因敲除小鼠模型,同时以野生型小鼠作为对照,分为Crnde基因敲除小鼠组(n=25)和野生型小鼠组(n=25),小鼠处死前12 h腹腔注射BrdU进行染色观察成骨细胞增殖,检测血清1型前胶原N末端(P1NP)和Ⅰ型胶原羧基端交联肽(CTX-Ⅰ)表达,蛋白质印迹法(Western blot)检测骨组织Wnt和β-catenin蛋白表达,原位缺口末端标记法(TUNEL)染色检测细胞凋亡情况,分别运用Osteomeasure系统和MicroCT分析进行骨组织形态计量分析,双荧光素酶报告基因验证Crnde与Wnt蛋白的靶向调节关系。组间比较采用t检验。结果成骨细胞分化过程Crnde表达情况为在诱导的3周时间内,随着时间延长,Crnde表达明显增加,在第3周表达最高(P>0.05);Wnt和β-catenin在Crnde^(-/-)小鼠和正常小鼠中表达情况中,蛋白质印迹法(Western blot)结果显示,Crnde^(-/-)组中Wnt和β-catenin蛋白表达低于WT小鼠组(P<0.05);BrdU免疫荧光染色结果显示,正常对照组小鼠胫骨存在大量BrdU阳性细胞,而Crnde^(-/-)小鼠细胞显著减少;TUNEL染色显示正常对照组小鼠与Crnde^(-/-)小鼠小鼠凋亡成骨细胞数量差异无统计学意义(P>0.05);μCT和Osteomeasure系统结果显示,椎骨的组织形态分析BV/TV,WT组[(19.43±1.53)%],Crnde^(-/-)组[(20.14±1.56)%],Crnde^(-/-)鼠的小梁和皮质骨均显示出低骨量表型,Crnde^(-/-)小鼠的骨形成参数均与野生型小鼠差异有统计学意义(P<0.05);Crnde^(-/-)小鼠血清P1NP和CTX-I分别为(15.62±1.23)μg/L和(12.36±1.12)μg/L,WT小鼠血清P1NP和CTX-Ⅰ分别为(22.81±1.56)μg/L和(16.21±1.21)μg/L,Crnde^(-/-)小鼠组均比WT小鼠组明显下降(P<0.05);双荧光素酶报告基因检测结果显示Crnde模拟物显著降低了野生型组荧光素酶活性(P<0.05),而对突变组荧光素酶活性基本无影响(P>0.05)。结论Crnde通过Wnt/β-catenin信号传导调节骨形成。

益骨汤含药血清通过经典Wnt信号通路促进成骨细胞增殖分化的研究

目的:在经典wnt信号通路抑制剂大鼠Dickkopf相关蛋白1(DKK1)的干预下,观察益骨汤含药血清对成骨细胞的经典Wnt信号通路的影响,探究益骨汤治疗骨质疏松的作用机制,为临床使用补肾活血中药防治骨质疏松症提供实验依据。方法:将40只雌性SD大鼠随机分成2组,益骨汤水提液组和空白对照组,连续灌胃10天,获取含药血清。从乳鼠颅盖骨中分离培养成骨细胞,实验分为4组,即A组(益骨汤含药血清组)、B组(DKK1组)、C组(DKK1+益骨汤含药血清组)、D组(空白血清对照组)。进行细胞增殖MTT检测、碱性磷酸酶活性检测,RT-PCR检测经典Wnt/β-catenin通路中β-链蛋白(β-catenin)、低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP-5)、DKK1基因的表达情况。结果:根据MTT法动态观察各组成骨细胞增殖,发现成骨细胞增殖呈规律性:48 h至72 h成骨细胞呈对数增长期,96 h后细胞增殖逐渐受到抑制。同一时间点与B组比较,A、C、D各组成骨细胞的增殖和ALP活性显著较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。同一时间点与D组比较,A组成骨细胞的增殖和ALP活性显著较高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与B组比较,A、C、D组β-catenin mRNA、LRP-5 mRNA、TCF mRNA的表达均明显升高,DKK1 mRNA的表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与D组比较,A组β-catenin mRNA、LRP-5 mRNA、TCF mRNA的表达均明显升高,DKK1 mRNA的表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:益骨汤含药血清可能是通过抑制DKK1的高表达,从而上调经典Wnt/β-catenin信号中β-catenin、LRP-5、TCF基因的表达,达到促进成骨细胞增殖,起到抗骨质疏松作用。