低氧微环境通过TGFBI调控Wnt/β-catenin通路介导胰腺癌化疗耐药及机制研究

目的:研究低氧微环境通过TGFBI调控胰腺癌耐药的作用及分子机制。方法:以CCK-8方法检测细胞增殖;以Western blotting技术检测蛋白表达水平;以ImageJ软件分析蛋白灰度值;RNAi技术用于敲减TGFBI基因。结果:TGFBI在Panc-1细胞中表达比正常细胞增强;低氧促进胰腺癌细胞Panc-1增殖并减弱顺铂对Panc-1的抑制作用,而高氧抑制Panc-1细胞增殖并加强顺铂的杀伤作用;低氧促进TGFBI表达及EMT行为;低氧通过TGFBI调控Panc-1细胞增殖及顺铂的杀伤作用;低氧通过TGFBI调控Wnt/β-catenin信号,进而促进EMT行为。结论:低氧微环境通过增强TGFBI表达促进胰腺癌细胞增殖及耐药;低氧微环境通过TGFBI激活Wnt/β-catenin信号通路,促进EMT标志分子表达。

下调METTL5通过Wnt/β-catenin信号通路抑制三阴乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭

目的探讨甲基转移酶5(methyltransferase-like 5,METTL5)在三阴乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)中的作用和潜在机制。方法采用免疫组织化学方法和Western blot检测TNBC肿瘤组织和细胞系中METTL5的表达情况。用靶向METTL5的shRNA(shRNA-METTL5)转染TNBC细胞后,用CCK-8、集落形成、伤口愈合以及Transwell实验分别检测细胞增殖活性、迁移与侵袭,Western blot检测Wnt/β-catenin信号关键蛋白的表达。构建异种移植瘤模型,验证敲降METTL5对TNBC细胞在体内生长以及Wnt/β-catenin信号活性的影响。结果METTL5在TNBC肿瘤组织和细胞系中表达上调(P<0.01)。敲降METTL5可抑制TNBC细胞的增殖、迁移和侵袭并降低了Wnt/β-catenin信号分子β-catenin、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-7的表达(均P<0.01)。体内实验显示,敲降METTL5减缓了移植瘤生长和Wnt/β-catenin信号活性。结论敲降METTL5能抑制TNBC细胞的增殖、迁移与侵袭,其作用可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

SOX7通过靶向调控SHP-2/Wnt/β-catenin/ROS通路抑制结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移

目的研究SOX7调控SHP-2/Wnt/β-catenin/ROS通路从而影响结直肠癌细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制。方法将20只裸鼠皮下移植瘤模型随机分为SOX7 NC组(n=5)、SOX mimic组(n=5)、SOX7 NC+PHPS1组(n=5)和SOX7 mimic+PHPS1组(n=5),观察肿瘤生长情况。通过脂质体法将人结直肠癌细胞系SW480细胞转染后,将细胞分为6组,分别为SOX7 NC组、SOX7 mimic组、SOX7 NC+H_(2)O_(2)组、SOX7 mimic+H_(2)O_(2)组、SOX7 NC+PHPS1组、SOX7 mimic+PHPS1组。通过Western blot实验检测各组SW480细胞SHP-2/Wnt/β-catenin/ROS通路相关蛋白的表达,通过细胞划痕实验和Transwell侵袭迁移实验检测SW480细胞的侵袭迁移能力,通过CCK-8检测SW480细胞的增殖。结果小鼠体内实验显示:SOX7 mimic组肿瘤体积明显小于SOX7 NC组(P<0.01),经过PHPS1干预的肿瘤体积明显增大,SOX7 mimic+PHPS1组肿瘤体积和SOX7 NC+PHPS1组的差异无统计学意义。体外实验发现:SOX7 mimic抑制了SW480细胞Wnt、β-catenin、NOX2、NOX4、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT蛋白表达(P<0.01),促进了p-SHP-2蛋白表达(P<0.01);加入H_(2)O_(2)和SHP-2抑制剂后SOX7 mimic组和SOX7 NC组的Wnt、β-catenin、NOX2、NOX4、PI3K、P-PI3K、AKT、P-AKT的蛋白表达水平升高,但差异无统计学意义,SHP-2、p-SHP-2蛋白的表达水平降低,但差异无统计学意义;细胞划痕、Transwell侵袭迁移实验和CCK-8实验结果表明SOX7通过氧化应激和SHP-2通路抑制了SW480细胞的迁移、侵袭和增殖(P<0.01)。结论SOX7可通过靶向SHP-2/Wnt/β-catenin/ROS通路抑制结直肠癌增殖、侵袭和迁移。

薯蓣皂苷抑制Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞凋亡的研究

目的研究薯蓣皂苷(DIO)对人HepG2肝癌细胞凋亡的影响及其可能抗癌作用机制。方法DIO(0.25、0.5、1、2、4、6和8μmol/L)干预HepG2肝癌细胞,MTT法检测细胞增殖情况,并计算半数抑制率(IC50);划痕实验分析细胞的迁移能力,Western blot检查细胞中凋亡因子及Wnt/β-catenin通路蛋白表达差异。结果与对照组比较,DIO组HepG2细胞抑制率显著升高(P<0.01),并诱导细胞在形态学上出现凋亡特点,呈时间与剂量依赖性;划痕实验结果显示DIO显著抑制HepG2细胞的迁移距离;与对照组比较,DIO干预细胞24 h后,Caspase-3、cleaved Caspase-3水平明显上调,而Bcl-2、β-catenin水平显著下调(P<0.05、P<0.01);采用LiCl激活Wnt/β-catenin信号通路,LiCl组细胞中Wnt1、β-catenin水平较对照组显著上调(P<0.01);与LiCl组比较,LiCl+DIO组HepG2细胞Wnt1、β-catenin、GSK-3β蛋白表达显著下调(P<0.01)。结论DIO体外能够促进HepG2肝癌细胞凋亡,机制可能是其下调β-catenin的蛋白表达,抑制Wnt/β-catenin信号通路传导,进而抑制凋亡因子Bcl-2表达,最终诱导细胞凋亡而发挥抗肝癌作用。

ADAMDEC1通过Wnt/β-catenin信号通路调控胰腺癌细胞的生长和转移

目的:探究敲减解整联蛋白及金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)结构域样癸蛋白1(ADAM domain-like decysin 1,ADAMDEC1)对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:利用GEPIA和UALCAN在线数据库对ADAMDEC1在胰腺癌组织中的表达情况进行分析。Western blot检测人胰腺癌细胞系(MIA PaCa-2和PANC-1)和胰腺导管细胞系(hTERT-HPNE)中ADAMDEC1的蛋白表达水平。采用CCK-8实验、集落形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验检测敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;Western blot检测敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞中迁移、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平的影响。此外,通过恢复性实验,检测Wnt/β-catenin信号通路激动剂CHIR-99021对敲减ADAMDEC1抑制胰腺癌细胞生长和转移作用的影响。结果:(1)ADAMDEC1在胰腺癌中高表达;(2)敲减ADAMDEC1表达后,胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降;(3)敲减ADAMDEC1后,E-cadherin蛋白表达增加,而基质金属蛋白酶9、N-cadherin和vimentin蛋白表达减少,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达亦减少;(4)CHIR-99021与ADAMDEC1小干扰RNA共处理胰腺癌细胞,可逆转敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。结论:ADAMDEC1在胰腺癌中高表达,可通过Wnt/β-catenin信号通路调控胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

外泌体负载枸杞miR2911调控Wnt/β-catenin信号通路促进非梗阻性无精子症大鼠生精功能恢复

目的:研究外泌体负载的枸杞miRNA(Lb-miR2911)药物通过跨界调控Wnt/β-catenin信号通路对非梗阻性无精子症(NOA)大鼠模型生精功能恢复的影响。方法:4周龄雄性SD大鼠30只,采用白消安腹腔注射方法构建NOA模型,造模5周后将模型大鼠随机分为模型组(MC)、Lb-miR2911^(EXO)治疗组(Lb-miR2911^(EXO))、外泌体空载治疗组(Sham),每组10只。MC组NOA模型大鼠自然恢复,无特殊处理;Lb-miR2911^(EXO)组NOA模型大鼠,睾丸生精小管注射外泌体包被Lb-miR2911药物(0.1 mg/kg),1次/周,共治疗3次;Sham组NOA模型大鼠,睾丸生精小管注射外泌体空载药物(0.1 mg/kg),1次/周,共治疗3次。另取10只同龄正常健康SD大鼠作为正常对照组(NC)。治疗后第2、6周采用RNA FISH技术观察Lb-miR2911药物在睾丸组织中的摄取及代谢变化;治疗后12周采用转录组测序分析结合Western印迹、RT-PCR方法检测各组大鼠睾丸组织中细胞增殖、精子发生及Wnt/β-catenin信号通路的基因表达;睾丸组织形态学及精子质量分析比较各组大鼠生精功能恢复情况;通过组织形态学分析结合血清TNF-α、IL-1β、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)等指标检测评估Lb-miR2911外泌体药物对大鼠组织器官毒性。结果:治疗12周后睾丸组织形态学分析发现Lb-miR2911^(EXO)组大鼠睾丸组织各层次生精细胞排列规则,管腔中可见大量成熟精子,与Sham组比较,Johnsen评分显著增加(P<0.05),睾丸重量、睾丸指数、精子浓度和精子活力显著增加(P<0.05);转录组测序分析结合Western印迹、RT-PCR方法证实,与MC组相比,Lb-miR2911^(EXO)组DACT3基因表达下调(P<0.05),而DVL2、β-catenin表达上调,同时p-DVL2及β-catenin(nucleus)蛋白含量增加(P<0.05);细胞增殖相关基因CCND1、CCNE1、CCNE2 mRNA表达上调(P<0.05);精子发生相关基因DMC1、CCR6、JAM2、KLC3表达上调(P<0.05);组织器官毒性检测表明:治疗后Lb-miR2911^(EXO)组大鼠肺部、肝脏、肾脏组织未见病理性变化,与NC组比较血清TNF-α、IL-1β、AST、ALT、肌酐或尿素氮等水平未见升高(P>0.05)。结论:外泌体负载的Lb-miR2911药物通过跨界调节DACT3/Wnt/β-Catenin信号通路促进了NOA大鼠生精功能恢复。

酒花提取物调控Wnt/β-catenin信号通路对去卵巢骨质疏松大鼠的作用及机制研究

目的探讨酒花提取物对去卵巢骨质疏松大鼠的作用及机制。方法将60只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组(戊酸雌二醇,0.105 mg·kg^(-1))和酒花提取物低、中、高剂量组(65.625、131.120、196.875 mg·kg^(-1)),每组10只。除假手术组外,其余各组大鼠均切除双侧卵巢,术后灌胃给药,每日1次,连续给药90 d。采用HE染色法观察大鼠骨组织病理形态变化,测定骨形态计量学参数,计算骨小梁数目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)和骨小梁面积百分数(Tb.Ar);测定大鼠骨组织生物力学指标:最大载荷、弹性模量、断裂强度;采用ELISA法测定大鼠血清雌激素(E_(2))、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP5b)、骨钙素(OC)、骨特异性碱性磷酸酶(BALP)含量;采用全自动生化仪测定大鼠血清碱性磷酸酶(ALP)含量;采用RT-PCR及Western Blot法检测大鼠胫骨组织OPG、RANKL、ERα、ERβ、Wnt16、β-catenin mRNA及蛋白表达水平。结果与假手术组相比,模型组大鼠胫骨骨小梁断裂,骨髓腔变大,呈现骨质疏松结构;胫骨Tb.N、Tb.Th、Tb.Ar明显降低(P<0.05),Tb.Sp明显升高(P<0.05);股骨的最大载荷、弹性模量和断裂强度均明显降低(P<0.05);血清E_(2)含量明显降低(P<0.05),TRACP5b、OC、ALP、BALP含量均明显升高(P<0.05);胫骨组织的OPG、OPG/RANKL、ERα、ERβ、β-catenin、Wnt16 mRNA及蛋白表达明显下调(P<0.05),RANKL mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.05)。与模型组相比,阳性对照组及酒花提取物高剂量组的上述指标均明显回调(P<0.05)。结论酒花提取物对绝经后骨质疏松症具有一定的防治作用,其作用机制可能与调控Wnt/β-catenin信号通路,进而调控OPG/RANK/RANKL信号通路有关。

基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨吴门骨密葆方含药血清促进间充质干细胞成骨分化的效应机制

目的基于Wnt/β-连环蛋白(β-Catenin)信号通路研究吴门骨密葆方含药血清促进骨髓间充质干细胞成骨分化机制。方法将大鼠骨髓间充质干细胞为正常血清组、经典诱导剂[间充质干细胞成骨诱导分化培养基(OBM)]组、吴门骨密葆方含药血清低(10 g生药/kg)和高剂量(20 g生药/kg)组、抑制剂[分泌型蛋白Dickkopf-1(DKK-1),0.1 ng·mL-1]组以及吴门骨密葆方含药血清低、高剂量+抑制剂组,成骨诱导分化后干预7 d时采用CCK8法检测细胞活力,随后采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色法和ALP试剂盒检测不同剂量吴门骨密葆方含药血清及加入Wnt/β-Catenin信号通路特异性阻滞剂DKK-1干预的间充质干细胞ALP染色强度和活性,Western Blot测定间充质干细胞Wnt信号蛋白家族3alpha(Wnt3a)、β-Catenin、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)、破骨细胞抑制因子(osteoprotegerin,OPG)和核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)蛋白表达水平。结果与正常组比较,吴门骨密葆方含药血清干预均可有效促进间充质干细胞增殖(P均<0.05),吴门骨密葆方含药血清可有效促进间充质干细胞ALP染色的强度和活性(P均<0.05),以及调控成骨分化相关的Wnt3a、β-Catenin、GSK3β、OPG和RANKL蛋白表达(P均<0.05),但是这些调控作用均可被DKK-1在一定程度上逆转。结论吴门骨密葆方含药血清诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化,可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路以及影响OPG/RANKL通路而实现。

杨梅素调节Wnt/β-catenin信号通路对腰椎间盘突出症大鼠椎间盘退变的影响

目的:探究杨梅素(MYR)调节Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路对腰椎间盘突出症(LDH)大鼠椎间盘退变的影响。方法:将大鼠随机分为Sham组、LDH组、MYR组、MYR+LiCl组(Wnt/β-catenin信号通路激活剂),每组12只,除Sham组外采用自体髓核移植法复制LDH大鼠模型,造模成功后进行药物干预,每天1次,持续28d。von Frey Hair纤维丝、辐射热痛觉测分析大鼠疼痛敏化行为;ELISA法检测血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)水平;HE染色法观察椎间盘组织病理变化;TUNEL染色法测定髓核细胞凋亡;免疫组化检测大鼠椎间盘组织中基质金属蛋白酶(MMP)13表达;Western blot分别检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达。结果:与Sham组比较,LDH组大鼠髓核细胞皱缩、排列不规则,数量减少,纤维环破裂,MWT与TWL降低,TNF-α、IL-1β含量、椎间盘组织病理评分、髓核细胞凋亡率、MMP13、Wnt3a、β-catenin表达升高(P<0.05);与LDH组比较,MYR组髓核细胞形态、纤维环结构显著改善,大鼠MWT与TWL升高,TNF-α、IL-1β含量、椎间盘组织病理评分、髓核细胞凋亡率、MMP13、Wnt3a、β-catenin表达降低(P<0.05);Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl可升高血清炎症因子水平,促进髓核细胞凋亡,加重椎间盘组织病理损伤,减弱了MYR对LDH大鼠椎间盘退变的延缓作用(P<0.05)。结论:MYR可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,降低炎症反应,减少髓核细胞凋亡,从而改善LDH大鼠的椎间盘退变。

KRT6A介导Wnt/β-catenin信号通路调节上皮-间质转化促进非小细胞肺癌A549细胞抗辐射

目的 探讨KRT6A对非小细胞肺癌A549细胞抗辐射的促进作用,并阐明其作用机制。方法 诱导并建立抗辐射A549(A549-RR)细胞,通过CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术验证细胞构建成功。Western blotting检测A549和A549-RR细胞中KRT6A表达情况。将A549-RR细胞分为敲减对照组(sh-NC组)和敲减KRT6A组(sh-KRT6A组),Western blotting检测KRT6A、上皮-间质转化(EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug)以及β-catenin的表达;采用CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况。将A549-RR细胞分为sh-NC组、sh-KRT6A组、敲减KRT6A和过表达对照(shKRT6A+ov-NC组)以及敲减KRT6A和过表达β-catenin (sh-KRT6A+ov-β-catenin组),Western blotting检测β-catenin以及EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表达;采用CCK-8法、平板克隆形成实验和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况。结果 成功建立了A549-RR细胞,A549-RR细胞中KRT6A表达上调。敲减KRT6A降低A549-RR细胞增殖活性和克隆形成能力,增加细胞凋亡率,上调E-cadherin蛋白表达并下调N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug和β-catenin蛋白表达;过表达β-catenin可逆转此作用。结论 KRT6A在A549-RR细胞中表达上调,敲减KRT6A可降低A549-RR细胞的抗辐射能力,其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路诱导的EMT有关。

山仙颗粒对Hepa1-6肝癌细胞迁移与侵袭及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的观察山仙颗粒含药血清对Hepa1-6肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响,并基于上皮-间充质转化(EMT)和Wnt/β-catenin信号通路探讨其可能的分子机制。方法采用SD大鼠制备山仙颗粒低、中、高剂量含药血清和空白血清。体外培养Hepa1-6肝癌细胞,设空白血清组、KYA1797K组及山仙颗粒低、中、高剂量含药血清组。取各组干预12 h、24 h、36 h后的Hepa1-6肝癌细胞,通过划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力,Western blot法检测细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、β-catenin和磷酸化糖原合成酶激酶3β(p-GSK3β)蛋白表达情况。结果与空白血清组比较,山仙颗粒中、高含药血清组及KYA1797K组干预12 h后的细胞迁移距离和山仙颗粒各组及KYA1797K组干预24 h、36 h后的细胞迁移距离均明显缩短(P均<0.05);山仙颗粒各组及KYA1797K组干预12 h、24 h、36 h后的穿膜细胞数量均明显减少(P均<0.05),细胞中E-cadherin蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中N-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-GSK3β蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。山仙颗粒低、中、高剂量含药血清组各时间点的细胞迁移距离呈剂量依赖性缩短,穿膜细胞数量呈剂量依赖性减少,细胞中E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白相对表达量呈剂量依赖性升高或降低,组间两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论山仙颗粒可以剂量依赖性地抑制Hepa1-6肝癌细胞的迁移和侵袭,其机制可能与调控Wnt/β-catenin通路,上调E-cadherin和下调N-cadherin、Vimentin的表达,从而抑制细胞EMT进程有关。

姜黄素对葡萄膜黑色素瘤细胞恶性生物学行为及Wnt/β-catenin通路的抑制作用

目的探究姜黄素对葡萄膜黑色素瘤(UM)恶性生物学行为的抑制作用及机制。方法应用含不同浓度(0、20、40和80μmol/L)姜黄素培养液培养M23细胞48 h,于倒置显微镜下观察细胞形态学改变;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞存活率;分别采用平板克隆形成实验、流式细胞术、细胞划痕实验及Transwell实验检测M23细胞集落形成、凋亡、迁移及侵袭情况;采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Wnt/β-catenin通路相关基因c-Myc、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、Survivin及基质金属蛋白酶9(MMP-9)mRNA相对表达情况;采用Western blot法检测Wnt/β-catenin通路相关蛋白c-Myc、Cyclin D1、Survivin、MMP-9、β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)及轴抑制蛋白2(Axin2)蛋白相对表达量。另取20只6周龄雌性BALB/c小鼠,左后腹皮下脂肪垫注射M23细胞悬浮液建立小鼠M23体内移植肿瘤模型,将造模成功小鼠按照随机数字表法随机平均分为模型组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组,每组5只,分别腹腔内注射0、10、20和40 mg/kg姜黄素生理盐水溶液,连续注射30 d后剥离皮下瘤体并称质量。结果0μmol/L姜黄素组、20μmol/L姜黄素组、40μmol/L姜黄素组和80μmol/L姜黄素组细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(83.78±4.59)%、(66.09±3.92)%和(47.16±3.63)%,细胞集落形成数分别为128.67±9.18、100.33±8.73、58.67±6.55和31.67±4.92,细胞凋亡率分别为(1.33±0.29)%、(14.53±2.04)%、(27.23±3.56)%和(44.73±4.36)%,细胞迁移率分别为(89.76±4.57)%、(65.43±3.70)%、(34.83±2.19)%和(18.82±1.99)%,细胞侵袭数分别为148.33±8.18、125.33±7.41、73.67±6.34、45.67±5.31,各组M23细胞存活率、集落形成数、细胞凋亡率、细胞迁移率、细胞侵袭数总体比较差异均有统计学意义(F=125.321、97.941、72.516、277.097、139.006,均P<0.001)。随姜黄素作用浓度的增大,细胞存活率、集落形成数、细胞迁移率、细胞侵袭数均明显降低,细胞凋亡率均明显增加,组间两两比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。随姜黄素浓度的增大,细胞中c-Myc、Cyclin D1、Survivin和MMP-9 mRNA和蛋白及β-catenin和p-GSK-3β蛋白相对表达水平均明显降低,Axin2蛋白相对表达水平明显升高,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。小鼠荷瘤质量随姜黄素作用剂量的增加而降低,组间比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论姜黄素可抑制UM细胞M23增生、迁移、侵袭等恶性生物学行为,抑制肿瘤生长,促进细胞凋亡,其作用机制可能与阻断Wnt/β-catenin通路激活有关。

基于Wnt/β-catenin信号通路的健骨伸筋汤对膝骨关节炎患者的干预作用研究

目的:健骨伸筋汤通过Wnt蛋白/β-连环素(Wnt/β-catenin)信号通路对膝骨关节炎(KOA)干预效果的研究。方法:将48只雌性斯泼累格·多雷(SD)大鼠随机分成空白对照组、模型组、美洛昔康片组、抗骨增生片组及健骨伸筋汤中剂量、高剂量组,每组8只。除空白对照组外,其余大鼠均向关节腔注射木瓜蛋白酶进行KOA造模。造模成功后空白对照组与模型组予以正常饮食饮水,其余大鼠分别予以美洛昔康药液、抗骨增生药液及健骨伸筋汤药液灌胃,干预4周。观察大鼠行动程度、膝关节肿胀度;检测血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)炎症介质水平,观察关节软骨病理变化,检测软骨中的β-catenin和Wnt4mRNA表达水平。结果:IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度比较,模型组高于空白对照组;美洛昔康组与抗骨增生组比较差异无统计学意义;与模型组比较,用药4组低于模型组;健骨中剂量组低于健骨高剂量组;与健骨中剂量组比较,美洛西康组和抗骨增生组略高于健骨中剂量组,差异无统计学意义;Wnt4与β-catenin的mRNA表达水平:Wnt4模型组表达水平提高,在各给药组水平有所降低;β-catenin的mRNA表达水平,模型组有所降低,在各给药组水平有所提高,健骨伸筋汤骨代谢调节有效。结论:健骨伸筋汤治疗KOA可能是通过Wnt/β-catenin信号通路来抑制炎症介质,调控信号通路内的蛋白来影响骨代谢。

miR-16-5p调控Wnt/β-catenin通路活性在力学载荷促进骨形成中作用的小鼠在体研究

目的 探究LRP6是否为miR-16-5p靶基因及miR-16-5p调控Wnt/β-catenin通路活性在力学载荷促进小鼠骨形成中的作用。方法 利用microRNA信息库预测miR-16-5p的靶基因,行荧光素酶报告实验来验证LRP6是否为miR-16-5p的靶基因。构建跑台组和对照组小鼠验证不同力学环境下骨组织中miR-16-5p及LRP6是否差异表达。制造miR-16-5p差异表达及力学加载动物模型:正常+miRNA Agomir control组(A组)、正常+miR-16-5p Agomir组(B组)、跑台+miRNA Agomir Control组(C组)及跑台+miR-16-5p Agomir组(D组)。干预完成后处死小鼠获取骨组织,检测各组LRP6、β-catenin及Runx2 mRNA及蛋白表达变化,行股骨远端Micro-CT扫描及股骨干生物力学测试检测骨量及力学性能变化。结果 microRNA信息库显示LRP6为miR-16-5p的可能靶基因,荧光素酶报告实验验证LRP6是miR-16-5p的靶基因。与对照组相比,跑台组小鼠骨组织中miR-16-5p表达明显降低,LRP6 mRNA表达明显升高。与A组相比,B组骨组织中LRP6、β-catenin及Runx2表达减低,骨体积分数、骨小梁厚度及生物力学性能减低。与A组相比,C组显著提高了骨组织中LRP6、β-catenin及Runx2的表达,骨体积分数、骨小梁厚度及生物力学性能均提高。与C组相比,D组结果显示LRP6、β-catenin及Runx2表达水平、骨量及生物力学性能均降低。结论 miR-16-5p能够通过靶向下调Wnt/β-catenin通路共受体中LRP6蛋白的表达而降低Wnt/β-catenin通路活性,降低小鼠骨量及骨生物力学性能,而力学载荷能够降低小鼠骨组织中miR-16-5p水平而提高LRP6蛋白表达及成骨活性和骨量。

布托啡诺调节Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞增殖迁移和血管生成的影响

目的:探讨布托啡诺调节Wnt/β-catenin信号通路对肺癌细胞增殖、迁移和血管生成的影响。方法:将肺癌H1299细胞分为对照组、布托啡诺低、高剂量组、布托啡诺高剂量+LiCl(Wnt/β-catenin信号通路激活剂)组、FH535组(Wnt/β-catenin信号通路抑制剂)。克隆形成实验检测细胞克隆能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭;流式细胞术检测细胞凋亡率;血管拟态形成实验观察血管生成情况;western blot检测VEGF-A、VE-cadherin、Bcl-2、Bax、MMP-9、β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白表达。结果:对照组H1299细胞管腔结构完整;与对照组相比,布托啡诺低、高剂量组和FH535组H1299细胞克隆形成率、细胞迁移和侵袭个数、管腔数量及VEGF-A、VE-cadherin、Bcl-2、MMP-9、β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白表达降低,细胞凋亡率和Bax蛋白表达升高(P<0.05);LiCl可部分逆转布托啡诺对H1299细胞恶性生物学行为的抑制(P<0.05);FH535组H1299细胞各项检测指标与布托啡诺高剂量组处于同一水平(P<0.05)。结论:布托啡诺能够诱导肺癌细胞凋亡,阻滞迁移、增殖和血管生长,进而阻止肺癌的发生发展,其机制与阻断Wnt/β-catenin信号通路激活相关。

番泻苷B通过Wnt/β-catenin通路抑制视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞增殖、凋亡和侵袭

目的探究番泻苷B对视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞增殖、凋亡、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法通过采用不同剂量(0、5、10、20μmol/L)番泻苷B处理HXO-Rb44细胞,将细胞随机分为4组:Control组,番泻苷B 5、10、20μmol/L组。MTT法检测细胞活力;克隆形成实验检测克隆形成率;流式细胞仪检测细胞凋亡率;Transwell检测侵袭细胞数;细胞成球实验检测细胞成球直径和细胞成球数目;蛋白质印迹检测cleaved caspase-3、caspase-3、MMP-2、MMP-9、SOX2、OCT4、CD44、Wnt1、β-catenin蛋白表达。结果与Control组比较,番泻苷B 10、20μmol/L组细胞活力、克隆形成率显著降低(P<0.05),细胞凋亡率和cleaved caspase-3/caspase-3表达显著升高(P<0.05),侵袭细胞数和MMP-2、MMP-9蛋白表达显著降低(P<0.05),细胞成球直径、细胞成球数目和SOX2、OCT4、CD44蛋白表达显著降低(P<0.05),Wnt1、β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论番泻苷B可抑制视网膜母细胞瘤HXO-Rb44细胞增殖、侵袭和干细胞样特性,诱导细胞凋亡,抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化。

基于Wnt/β-catenin信号通路探讨雷公藤甲素联合脉冲射频对大鼠神经性疼痛模型抗炎镇痛的作用机制

目的 探讨雷公藤甲素联合脉冲射频对大鼠神经性疼痛模型的抗炎镇痛作用及相关机制。方法 将SD大鼠随机分为假手术组、脊神经结扎组、雷公藤甲素组、脉冲射频组、雷公藤甲素联合脉冲射频组。构建脊神经结扎模型大鼠,检测大鼠疼痛行为学变化;蛋白质印迹法检测坐骨神经组织中Wnt-3α、β-catenin、frizzled7蛋白表达;聚合酶链式反应检测坐骨神经组织中Il-1β、Cox-2、Tnf-α、p65 Nf-κB mRNA表达;免疫组织化学检测坐骨神经组织中SP和C-fos蛋白表达。结果 除假手术组外,其余各组机械性缩足反射阈值在术后第1天急剧下降,术后第5天脊神经结扎组的机械性缩足反射阈值趋于稳定,各治疗组的机械性缩足反射阈值逐渐上升。除假手术组外,其余各组热缩足反射潜伏期在术后前3天急剧下降,术后第3天各组热缩足反射潜伏期开始升高,各治疗组的升高速度均高于脊神经结扎组。蛋白质印迹法结果显示术后第3、7、14天,脊神经结扎组Wnt-3α、β-catenin、frizzled7蛋白表达升高。与脊神经结扎组比,术后第3天各治疗组Wnt-3α、β-catenin、frizzled7蛋白表达差异较小,术后第7天和第14天各治疗组蛋白表达均降低,且雷公藤甲素联合脉冲射频组的相对表达量最低。聚合酶链式反应结果显示术后第3、7、14天,与假手术组比,脊神经结扎组的Il-1β、Cox-2、Tnf-α、p65 Nf-κB mRNA表达升高。与脊神经结扎组比,术后第7天和第14天各治疗组的mRNA表达均降低,且雷公藤甲素联合脉冲射频组表达最低。免疫组织化学结果显示脊神经结扎组中SP和C-fos蛋白表达高于假手术组,且随着时间的延长两种蛋白表达逐渐升高。与脊神经结扎组比,各治疗组SP、C-fos蛋白表达水平随治疗时间的延长均降低,且雷公藤甲素联合脉冲射频组降低最明显。结论 雷公藤甲素联合脉冲射频治疗通过调控Wnt/β-catenin信号通路减轻大鼠神经性疼痛模型炎症和疼痛反应。

基于Wnt/β-catenin通路探究迷迭香酸对结直肠癌上皮-间质转化的抑制作用

目的探讨迷迭香酸(rosmarinic acid,RA)对结直肠癌(colorectal cancer,CRC)SW480细胞恶性行为的影响及机制。方法通过收集2019年1月至2020年12月在如皋市人民医院接受手术治疗的初诊未经治疗的CRC患者的肿瘤组织以及正常人的结肠组织,用免疫组化和Western blotting方法检测β-catenin的表达,分析与临床分期、预后和免疫浸润的关系。CCK-8检测10、15、20μmol/L的RA对SW480细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Transwell和划痕实验分别检测细胞的侵袭和迁移能力变化;Western blotting检测凋亡、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及Wnt/β-catenin通路的相关蛋白表达情况。CRC SW480细胞系悬液皮下接种制作移植瘤小鼠模型,150 mL/kg RA溶液灌胃,观察RA对移植瘤生长的影响,ELISA检测了血清炎症因子变化。结果正常结肠组织中β-catenin的表达很低,而CRC组织中β-catenin的表达明显增高。在CRC患者β-catenin高表达组中,肿瘤大于5 cm的患者数显著高于低表达组,而患者总生存期却显著小于低表达组(P<0.05)。各浓度RA组细胞增殖显著抑制,且呈浓度依赖性降低(P<0.05)。移植瘤小鼠模型中,RA处理组凋亡蛋白Bax和Bad表达较对照组显著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少(P<0.05)。同时可见SW480细胞的侵袭和迁移能力显著被抑制(P<0.05),E-cadherin蛋白表达显著增加,Snail、N-cadherin和Vimentin表达显著减少(P<0.05),而且Axin和GSK-3β表达增加,β-catenin表达减少(P<0.05)。结论RA可能通过干预Wnt/β-catenin通路介导的EMT抑制SW480的生物学活性。

miR-148a通过调节Wnt/β-catenin信号通路改善椎间盘组织退变的机制

目的探讨miR-148a通过调节Wnt/β-catenin信号通路改善椎间盘退变(IDD)的机制。方法以白细胞介素(IL)-1β诱导建立IDD大鼠和细胞模型。观察miR-148a对如下观察指标的影响:椎间盘组织病理形态,椎间盘软骨组织,椎间盘髓核细胞活力及凋亡,血清及椎间盘髓核细胞的IL-6与IL-18水平,椎间盘组织及髓核细胞机制标记物蛋白Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、蛋白聚糖(Aggrecan)的表达;椎间盘组织及髓核细胞miR-148a、Wnt/β-catenin通路相关蛋白(Wnt、β-catenin)的表达。结果与假手术组(大鼠)/对照组(细胞)比较,模型组大鼠椎间盘组织发生退变且软骨基质大量流失,髓核细胞活力及CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达均降低(P<0.05),髓核细胞凋亡率、IL-6、IL-18、Wnt及β-catenin蛋白表达均升高(P<0.05)。与模型组比较,miR-148a过表达组大鼠椎间盘组织退变及软骨基质流失症状减轻,髓核细胞活力、CollagenⅡ、Aggrecan蛋白表达均升高(P<0.05),髓核细胞凋亡率、IL-6、IL-18、Wnt及β-catenin蛋白表达均降低(P<0.05)。结论miR-148a可通过下调Wnt/β-catenin信号通路表达而抑制炎症,进而减轻IDD大鼠椎间盘及软骨损伤,缓解软骨基质流失及髓核细胞凋亡,改善大鼠椎间盘组织退变症状。

中药复方基于Wnt/β-catenin信号通路调控糖尿病肾病研究进展

糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一,也是造成终末期肾病的主要原因。Wnt/β-catenin信号通路与糖尿病肾病肾小管间质纤维化密切相关,主要通过足细胞、肾小球系膜细胞、肾小管上皮细胞等来改善糖尿病肾病。中药复方基于调控Wnt/β-catenin信号通路来改善肾脏病变及纤维化,保护肾脏功能,进而延缓病程进展,在治疗中发挥激活自噬、减少炎症反应及减弱氧化应激等作用。目前,关于中药复方基于Wnt/β-catenin信号通路的研究仍存在以下不足之处:(1)在中药复方的研究中,能够得出中药复方可通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用,但由于中药复方成份复杂多样,大多数仅仅发现相关性,而没有分析其具体的活性成分;(2)Wnt/β-catenin信号通路的相关研究并未深入探索该信号通路在肾纤维化中的作用机制;(3)目前关于中医药的大部分实验为动物体内实验,缺乏体外细胞的相关实验探究。今后,需加强对中药复方活性成分的研究,并开展更多的体外细胞实验,进行深层次的作用机制及靶点研究。