大鼠骨髓间充质干细胞成牙本质向分化中Wnt信号通路磷酸化抗体芯片分析

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)成牙本质向分化过程中,Wnt信号通路主要信号分子的磷酸化变化,初步探讨其作用机制。方法全骨髓贴壁法培养大鼠BMSC,利用新生大鼠牙胚制备牙胚细胞条件培养基,诱导大鼠BMSC向成牙本质向分化,应用Wnt信号通路磷酸化抗体芯片技术检测诱导组与对照组Wnt信号通路蛋白磷酸化水平并筛选出调变磷酸化位点,应用蛋白印迹法(Western blot)验证芯片结果。采用SPSS 20.0软件进行统计分析,采用独立样本t检验和校正t检验分析组间差异。结果全骨髓贴壁法获得自我更新和多向分化潜能的BMSC,经牙胚细胞条件培养基诱导2 d后,细胞形态开始转变为梭形,7 d后形成长梭形并螺旋状排布生长,成牙本质相关蛋白DSPP(t=3.700,P=0.021)、DMP1(t=3.237,P=0.032)、RUNX2(t=12.09,P<0.000)、ALP(t=62.83,P<0.001)表达水平上调,成功诱导BMSC向成牙本质向分化,Wnt信号通路磷酸化抗体芯片检测发现27个磷酸化调变位点,Western blot检测结果显示核内β-catenin表达上调(t=4.588,P=0.044),PKCδ磷酸化水平上调(t=5.438,P=0.032)、AKT磷酸化水平下调(t=30.85,P=0.001),与芯片结果一致。结论通过Wnt信号通路磷酸化抗体芯片分析,获得BMSC成牙本质向分化过程中,Wnt信号通路磷酸化位点变化。

益肾喘宁汤干预肾气虚哮喘大鼠Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片分析

目的:研究肾气虚哮喘发生发展过程中以及益肾喘宁汤干预后,Jak-STAT信号通路主要信号分子的磷酸化水平变化,初步探讨验方干预机制。方法:建立肾气虚哮喘大鼠模型后,取出各组大鼠肺组织,应用Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片技术检测各组大鼠Jak-STAT信号通路蛋白磷酸化水平并筛选出调变磷酸化位点。结果:成功建立肾气虚哮喘大鼠模型,Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片检测结果显示,与正常组相比,肾气虚哮喘组大鼠有3个位点上调,5个位点下调;与肾气虚哮喘组相比,中药组有2个位点上调。结论:通过Jak-STAT信号通路磷酸化抗体芯片检测分析,获得益肾喘宁汤干预肾气虚哮喘大鼠的Jak-STAT信号通路磷酸化位点变化。

基因芯片技术分析骨髓间充质干细胞神经分化中Wnt信号通路的激活

背景:通过对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样分化的Wnt信号调控机制进行研究,为骨髓间充质干细胞在脊髓损伤及组织工程中的应用打下基础。目的:应用基因芯片技术测试人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中相关基因的表达变化。方法:分离和纯化人骨髓间充质干细胞,选取第5代细胞,基于Gateway^(TM)载体构建技术构建慢病毒载体,将Wnt-1转导至人骨髓间充质干细胞。设置3个实验组,分别为对照组、未转导组以及转导组,诱导人骨髓间充质干细胞神经分化,扫描电镜下观察细胞形态,应用基因芯片检测Wnt信号通路基因的调控变化及差异表达。结果与结论:(1)扫描电镜下发现:转导Wnt-1并诱导分化的细胞具有神经元样细胞的形态。(2)基因芯片杂交技术检测发现:3 287个基因上调,4 215个基因下调,与神经系统发育和分化相关基因有上调和下调的变化。(3)从中挑选了相关基因验证,表明转导Wnt-1后细胞内Wnt通路激活,下游基因转录,促进人骨髓间充质干细胞的神经分化。

骨髓间充质干细胞神经分化中Wnt信号通路的基因芯片分析

目的通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)转导Wnt-3a并诱导向神经细胞分化后相关基因的表达变化,寻找Wnt信号通路中调控BMSCs神经分化的靶基因。方法密度梯度离心加差速贴壁法体外分离和纯化BMSCs,原代培养2周后传代。观察细胞形态特征。基于GatewayTM技术构建双表达慢病毒载体,将Wnt-3a转导至BMSCs。设置转导组、未转导组及对照组,其中转导组和对照组转导Wnt-3a,转导组为扩增后的BMSCs-Wnt-3a,对照组取同时期BMSCs-Wnt-3a,未转导组未转导Wnt-3a。诱导转导组和未转导组细胞神经分化,倒置相差显微镜下观察细胞形态。采用基因芯片技术检测Wnt信号通路基因的改变,用RT-PCR来验证相关基因的上调或者下调。结果找到2 959个基因上调,4 623个基因下调。在Wnt信号通路的89个基因当中,与神经系统发育和分化相关基因有不同的变化。从中挑选了2个基因做RT-PCR验证,结果表明与芯片结果一致。结论 Wnt通路激活后,下游的基因转录,促进神经分化。

Wnt/β-catenin信号通路抑制剂的抗肿瘤研究进展

Wnt信号通路广泛存在于多细胞真核生物中,并且高度保守,在胚胎发育过程中起到重要作用。大量研究表明,Wnt信号通路的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关,其在多种恶性肿瘤的增殖、分化、凋亡、迁移、侵袭、上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)及肿瘤干细胞特性中发挥重要作用,因此开发靶向Wnt信号通路的抗肿瘤药物具有重要意义。目前,Wnt信号通路抑制剂的研究已取得一定进展。本文主要对近年来Wnt途径中关键成员Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂在肿瘤治疗中的研究进展作一综述。

骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化过程中Wnt信号通路的调控效应

背景:骨髓间充质干细胞的成脂肪分化与成骨分化比例的失衡与许多骨疾病密切相关,而近些年发现Wnt信号通路在调控骨髓间充质干细胞的分化方向中起重要作用。目的:通过Wnt信号通路PCR基因芯片观察大鼠骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞和成骨细胞后相关基因表达的变化,寻找Wnt信号通路中调控骨髓间充质干细胞分化的靶基因。方法:采用大鼠第3代骨髓间充质干细胞分别进行成骨诱导和成脂诱导,7d后用Trizol萃取培养瓶中的细胞总RNA,倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态特征及成骨诱导后和成脂诱导后细胞形态特征。采用Wnt信号通路PCR芯片(大鼠)进行基因芯片检测,以未诱导组为对照,计算成脂肪诱导,成骨诱导后相关基因上调/下调的比值。结果与结论:①倒置显微镜下观察,传3代后可获得均一性较高的骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞经成骨诱导后向成骨细胞方向分化,经成脂诱导后向脂肪细胞方向分化。②与未诱导组相比,骨髓间充质干细胞成脂诱导后Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk-1,kremen,FZD1,FZD7)等15个(ratio>2),下调的基因(sFrp5,β-catenin,Dvl3,Tcf7)等16个(ratio<0.5)。成骨诱导后,Wnt信号通路表达上调的基因(Dkk1,kremen,β-catenin,Wnt11)6个,表达下调的基因(sFrp5,sFRP4,Fzd1)等15个。提示Wnt信号通路在骨髓间充质干细胞成脂细胞分化和成骨细胞分化中发挥重要作用。

蛋白质修饰对Wnt信号通路的调控

Wnt信号通路与细胞的生长发育和分化等密切相关,是细胞中重要的信号转导途径,在多种癌症中,都有该通路的异常改变.Wnt信号通路主要是通过一系列蛋白将Wnt信号传导至β连环蛋白(β-catenin,β-cat),使后者入核并与转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子(Tcell factor/lymphoidenhancer factor,TCF/LEF)结合,从而促进下游基因的转录,进而调控细胞的多种生理过程.在该通路中,涉及轴蛋白(Axin)、结肠腺瘤样息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli,APC)、糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、β连环蛋白和酪蛋白激酶I(casein kinase I,CKI)等众多调节因子,这些因子能发生多种化学修饰,如磷酸化、泛素化(ubiquitylation)、苏素化(small ubiquitin related-moditier,SUMO)和乙酰化等,从而影响β连环蛋白、T细胞因子的稳定性、细胞定位以及活性,最终起到调节Wnt信号通路的作用.

人参皂苷Rg3调控WNT/β-catenin信号通路抑制结肠癌细胞生长的实验研究

目的探讨人参皂苷Rg3通过影响WNT/β-catenin信号通路中关键蛋白β-catenin从而阻断结肠癌细胞生长机制的研究。方法 MTT法检测不同浓度人参皂苷Rg3对人结肠癌细胞系SW480、HCT116细胞增殖的影响;流式细胞仪检测不同浓度人参皂苷Rg3对SW480、HCT116细胞凋亡及磷酸化β-catenin的影响;RT-PCR和Western blot法检测HCT116细胞中β-catenin及c-myc的表达。结果人参皂苷Rg3具有抑制SW480、HCT116细胞增殖和促进凋亡的能力。一定浓度人参皂苷Rg3能够降低β-catenin蛋白的磷酸化程度,下调β-catenin mRNA的表达,下调β-cetanin和c-myc蛋白的表达。结论人参皂苷Rg3具有一定的抗肿瘤活性,可有效抑制HCT116和SW480细胞生长,且这种作用可能是通过下调β-catenin磷酸化来实现的。

创伤性深静脉血栓形成大鼠模型Wnt信号通路的作用

背景:创伤后深静脉血栓形成具有潜在的临床危害性,可并发肺栓塞、脑栓塞。Wnt信号途径调节控制多种疾病过程,可能影响深静脉血栓的形成。目的:探讨Wnt信号通路在创伤性深静脉血栓形成中的作用。方法:将30只SD大鼠随机分为正常对照组和模型组。模型组根据造模后的不同生物学状态再分为高峰期血栓形成组和高峰期血栓不形成组,造模后5d无创切取股静脉血管组织,随后抽取各组大鼠总RNA,用Genechip Rat Genome 230 2.0芯片测定股静脉RNA表达,并分析Wnt信号通路基因表达变化情况。结果与结论:与正常对照组比较,血栓形成组发现1906个基因出现表达差异,无血栓形成组差异表达基因数目合计1568个;与无血栓形成组比较,血栓形成组有437个出现表达差异,其中Wnt信号通路卷曲相关蛋基因、膜联结合蛋白基因、酪蛋白激酶Ⅱ基因、p53基因、蛋白磷酶2A基因、环腺苷酸依赖性激酶同功酶基因、连接素β基因、原癌基因、fos相关抗原基因、Rac基因、钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ基因、钙调神经磷酸酶基因等均上调;卷曲蛋白基因、磷脂酶C基因等下调。提示Wnt信号通路可能是调控血栓的生物学状态的重要信号通路之一。

肝细胞癌Wnt信号通路差异表达基因的筛选及意义

目的检测肝细胞癌(HCC)中Wnt信号传导通路相关基因的差异表达情况,探讨HCC与该信号通路的关系。方法采用Affymetrix U133 Plus2.0基因芯片检测93例HCC及其配对癌旁组织中78个Wnt信号通路相关基因的mRNA表达差异。结果与癌旁肝组织相比,HCC组织中TCF19、MMP-12、DKK1、Bcl-9、SFRP4、MMP-1、PYGO2、FZD6、MMP-9、Wnt6共10个基因表达上调,而SFRP1、TCF21、SFRP5、FZD1、Wnt2共5个基因表达下调。其中,TCF19表达上调倍数最多,达9.61倍(P=1.07×10-26)。TCF19表达与FZD1、FZD6、Bcl-9、Wnt6、MMP-1和MMP-12表达呈正相关(均P<0.05)。TCF19表达与肿瘤数目(P=0.017)和分化程度(P=0.046)有关。结论 HCC中存在Wnt信号通路多基因异常表达。下游转录因子TCF19高表达可能是Wnt信号通路激活的关键终末效应,其在HCC中的生物学和病理学意义有待进一步研究。

结肠癌患者Wnt信号通路的变化和作用

目的探讨结肠癌患者Wnt信号通路的变化情况及其作用意义。方法利用Human Ge-nome U133Plus2.0基因芯片对结肠正常黏膜组织和癌组织基因表达谱进行检测,分析Wnt信号通路基因表达变化情况。结果Wnt信号通路中FRP、Frizzled、CK2、p53、PP2A、CKIα、JNK、CaMKII、CaN、c-jun、cyc-D等关键基因均呈下调,调控着细胞周期、基因转录等。结论Wnt信号通路可能是调控结肠癌演变过程的重要信号通路之一。

Wnt信号转导通路和肿瘤防治

Wnt信号转导途径可以分为决定细胞命运的经典途径和控制细胞运动及组织极性的非经典途径。经典WNT信号转导通路是Wnt蛋白通过与Frizzled(FZD)家族特异受体和LRP5/LRP6辅助受体结合,触发细胞内的信号转导,使β-连环蛋白(β-catenin)聚集的级联反应过程。非经典的Wnt信号被转导是通过Frizzled家族受体和ROR2/RYK联合受体结合到Dishevelled依赖(Rho family GTPases和c-junNH2-terminal kinase)或Ca2+依赖的信号级联反应。Wnt通路及其有关的其他通路在胚胎发育和肿瘤发生中起重要作用。在许多种人类癌病中,Wnt通路的负性调节基因突变失活。经优化选择分离出的择靶向作用于WNT信号途径的小分子复合物和人类单克隆抗体可以用于癌症的治疗。

窖蛋白对粘附斑激酶信号通路的影响

目的研究窖蛋白对粘附斑激酶活性的影响,探讨窖蛋白对粘附斑激酶信号通路的作用。方法采用体外培养第3代到第6代人脐静脉内皮细胞,以腺病毒介导其高表达窖蛋白,免疫印迹法检测粘附斑激酶活性,以抗粘附斑激酶397酪氨酸残基磷酸化抗体检测粘附斑激酶磷酸化水平。结果窖蛋白与粘附斑激酶形成免疫沉淀复合体,两者可以相互识别结合。与对照组相比,高表达窖蛋白抑制粘附斑激酶397酪氨酸残基磷酸化水平在纤粘连蛋白刺激前和刺激后分别降低了33%和35%。结论窖蛋白通过抑制粘附斑激酶的起始活性来抑制粘附斑激酶信号通路。

骨形态发生蛋白与细胞外基质磷酸化糖蛋白相关性研究进展

骨形态发生蛋白(BMP)是转化生长因子β超家族成员,细胞外基质磷酸化糖蛋白(MEPE)是一种细胞外基质的非胶原磷酸化糖蛋白,两者都是成骨信号通路中的重要蛋白。近年来发现MEPE表达水平受BMP的调节,并在磷酸盐代谢调节、成骨细胞增殖分化中发挥重要作用,同时与肿瘤细胞的骨转移有着密切的关联。在此,我们简要综述近年来BMP与MEPE的关系以及它们在肿瘤细胞骨转移方面的作用。

化痰祛瘀汤调控Wnt/β-catenin信号通路对血管性痴呆大鼠认知功能的影响

目的基于Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路观察化痰祛瘀汤对血管性痴呆大鼠β-catenin、GSK-3β蛋白表达及对认知功能相关蛋白抗心磷脂抗体(ACA)和β-淀粉样蛋白(Aβ)表达的影响。方法将96只雄性SD大鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、多奈哌齐组及化痰祛瘀汤低、中、高剂量组,每组16只。除空白组外,其余各组采用改良2-VO法制备血管性痴呆大鼠模型,中药低、中、高剂量组分别灌胃化痰祛瘀汤6.1、12.1、24.2 g/kg,西药组灌胃盐酸多奈哌齐0.5 mg/kg,空白组及模型组灌胃等量生理盐水,连续28 d。给药第1、7、14、28天进行Morris水迷宫实验评估大鼠学习记忆能力,ELISA法测定大鼠血清ACA、Aβ水平,Western blot法测定大鼠海马组织β-catenin、GSK-3β蛋白表达。结果与模型组比较,给药7、14 d化痰祛瘀汤高剂量组、多奈哌齐组逃避潜伏期缩短(P<0.05),给药1、28 d化痰祛瘀汤高剂量组大鼠穿台次数增多(P<0.05)。与模型组比较,给药后第1、7、14、28天,多奈哌齐组及化痰祛瘀汤中、高剂量组大鼠血清ACA水平降低(P<0.05);给药后第7、14、28天多奈哌齐组及化痰祛瘀汤中、高剂量组大鼠血清Aβ水平降低(P<0.05);给药后第14、28天,化痰祛瘀汤低剂量组大鼠血清ACA、Aβ水平降低(P<0.05)。与模型组比较,多奈哌齐组及化痰祛瘀汤中、高剂量组大鼠海马组织β-catenin蛋白表达升高(P<0.05),多奈哌齐组及化痰祛瘀汤低、中、高剂量组大鼠海马组织中GSK-3β表达降低(P<0.01)。结论化痰祛瘀汤可激活Wnt/β-catenin信号通路,上调海马组织中β-catenin蛋白表达,抑制GSK-3β蛋白表达,降低血清ACA、Aβ水平,改善血管性痴呆大鼠认知功能。

制备磷酸化抗体结合反相蛋白阵列探测细胞通路模型信号

通过制备、鉴定与筛选可靠应用于反相蛋白阵列(reverse-phase protein array,RPPA)的磷酸化抗体作为探针,建立LNCa P细胞中Akt、Erk/MAPK通路在4种方式(EGF、LY294、PMA、Na Cl)刺激下信号变化的细胞通路模型,利用RPPA技术探测细胞通路模型的信号。结果获得4组细胞通路模型的RPPA测定数据及25个RPPA适用性的磷酸化抗体探针。4组模型结果均显示了通路中关键信号分子响应于4个外部扰动的磷酸化状态的动态变化。RPPA结果数据与相应的免疫印迹法(Western blot)分析结果一致,证实了分析数据的有效性与可靠性。结果表明,所制备磷酸化抗体探针与RPPA平台结合,极适合于分析细胞信号通路模型。该方法能够有效地拓展RPPA探针范围,使其成为新药开发、临床样本分析等领域的先进工具。

应用组织芯片检测食管鳞状细胞癌中APC、β-catenin、E-cadherin与cyclin D1的表达及其意义

背景与目的:食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)的发生是个多因素多阶段的演进过程。Wnt信号转导通路在肿瘤发生发展中起重要作用。本研究探讨4种Wnt通路上的蛋白在食管鳞癌发生中的作用及在早期诊断中的意义。方法:制作由199例食管鳞癌组织与其癌旁164例正常粘膜、34例基底细胞增生和30例不典型增生上皮组成的组织芯片,应用免疫组化方法检测APC、β-catenin、E-cadherin、cyclin D1的表达情况。结果:APC和E-cadherin在ESCC阳性率分别是69.6%、19.6%,均低于各自正常组(98.0%、96.3%,均为P<0.01),β-catenin和cyclinD1在ESCC的异常表达率分别是65.5%和70.9%,均高于各自正常组(1.2%,0.8%,均为P<0.01)。按正常粘膜→基底细胞增生→不典型增生→ESCC的顺序,APC低表达发生在ESCC,β-catenin和E-cadherin表达异常始于不典型增生,cyclin D1过表达始于基底细胞增生。随着ESCC分化程度由高到低的改变,APC、E-cadherin和cyclin D1阳性率逐渐减少,β-catenin逐渐增加。β-catenin的表达与APC无相关(r=-0.10,P>0.05),与E-cadherin呈负相关(r=-0.31,P<0.01),与cyclin D1呈正相关(r=0.49,P<0.01)。结论:APC、E-cadherin、β-catenin和cyclin D1可能在ESCC发生过程中起重要作用。β-catenin、E-cadherin和cyclin D1的表达检测有助于ESCC的早期诊断。

棉铃虫转录因子c-Myc基因在滞育和非滞育蛹脑中的表达分析及多克隆抗体制备

【目的】c-Myc是近年来研究较多的转录因子,也是受Wnt/β-catenin信号通路调节的重要靶标。本研究旨在克隆棉铃虫Helicoverpa armigera c-Myc基因,从核酸水平初步调查c-myc在滞育和非滞育蛹脑中的表达情况,同时制备其蛋白的多克隆抗体。【方法】通过RACE方法克隆棉铃虫c-myc基因的c DNA,运用RT-PCR方法比较滞育和非滞育蛹脑中Har-c-myc基因的表达情况。根据获取的序列构建原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达,纯化后免疫新西兰兔,制备了多克隆抗体。【结果】克隆了棉铃虫c-myc基因,核酸水平的研究表明滞育蛹脑中c-myc表达水平明显低于非滞育蛹脑。成功地在大肠杆菌中表达了c-Myc部分肽段并通过镍柱纯化获得了较纯的重组蛋白。制备的c-Myc抗体效价达到了1∶125 000。【结论】滞育蛹脑中Har-c-myc的表达下调。获得了抗棉铃虫c-Myc的多克隆抗体。本研究的成果为后续进一步深入研究棉铃虫Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。

CAY10404靶向干预Wnt/β-catenin信号通路对多发性骨髓瘤干细胞清除作用的研究

Wnt信号被认为是多发性骨髓瘤(MM)致癌作用的一个重要角色。为了观察Wnt/β-catenin信号通路在多发性骨髓瘤特别是多发性骨髓瘤干细胞中的表达及Wnt/β-catenin信号通路抑制剂CAY10404对多发性骨髓瘤的治疗作用,对13个多发性骨髓瘤患者的骨髓样本和多发性骨髓瘤细胞株中的Wnt/β-catenin相关基因的表达情况进行分析和运用Western-blot方法分析β-catenin蛋白在多发性骨髓瘤不同细胞亚群中的表达及COX2抑制剂CAY10404对β-catenin蛋白表达的抑制,通过体内外试验观察CAY1040对多发性骨髓瘤不同细胞亚群的增殖抑制作用。结果显示Wnt/β-catenin信号通路在多发性骨髓瘤病人样本CD138-/CD19+干细胞亚群中比CD138+细胞亚群表达显著增高(P<0.05);体内外试验显示CAY10404明显抑制多发性骨髓瘤干细胞亚群的增殖(P<0.05)。该研究通过靶向干预Wnt/β-catenin信号通路,对治疗多发性骨髓瘤尤其是多发性骨髓瘤干细胞进行了探索。

阻断Wnt-1信号通路对裸鼠非小细胞肺癌的模型研究

目的通过建立宣威地区非小细胞肺癌的裸鼠移植瘤模型,探讨阻断Wnt-1信号传导通路对非小细胞肺癌的抑制作用。方法将21只重量16~18 g的荷瘤小鼠分为三组：空白组（n=7）、对照组（n=7）和实验组（n=7）。空白组注入生理盐水,对照组注入多西他赛,实验组注入Wnt-1抗体。待6次注射干预后,处死所有裸鼠获取肿瘤标本,比较其体积大小,比较空白组、对照组及实验组对肿瘤的抑瘤率。结果肿瘤体积在第21天和27天时空白组分别与实验组、对照组的差异有统计学意义（P=0.002,P=0.000）。体内实验结果显示,多西他赛和Wnt-1抗体对非小细胞肺癌均有抑制作用,多西他赛的抑制作用更强。结论阻断Wnt信号通路对肿瘤的生长有抑制作用,多西他赛和Wnt-1抗体对非小细胞肺癌的抑制有积极的效果。