Wnt-β-catenin信号通路特异性分子靶向药物研究进展

Wnt-β-链蛋白（β-catenin）信号通路具有调节细胞增殖、凋亡、组织修复等作用,该通路信号的异常与许多疾病相关包括纤维化、癌症等[1-2]。该通路关键环节均可成为临床治疗靶点,目前,干预该通路的靶向治疗剂取得了一定成果,部分治疗剂已进入临床试验阶段,但开发出安全、有效的治疗药物的任务还很艰巨。目前,经典WNT信号通路的特异性分子靶向药物大致有5类：β-catenin-T淋巴细胞因子（TCF）拮抗剂,

Wnt抑制分子Dkk3、SFRP1和SFRP4在子宫内膜癌中的表达分析

目的研究Dickkopf相关蛋白3(Dickkopf-related protein 3,Dkk3)、分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled-related protein 1,SFRP1)和SFRP4在子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)发生、发展中的作用及病理相关性。方法收集EC标本58例,子宫内膜正常组织30例。用RT-PCR、Western blot法检测组织中Dkk3、SFRP1和SFRP4的表达变化。结果Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期子宫内膜癌组织和正常组织比较,Dkk3、SFRP1和SFPRP4的mRNA及蛋白表达水平降低,并随着组织分期程度的升高而降低(均P<0.05)。结论 Dkk3、SFRP1和SFRP4与EC的分期呈负相关,可考虑作为EC的分期标志。

姜黄素对人胚胎干细胞向视网膜色素上皮样细胞定向诱导效率的促进作用

背景 来源于多能干细胞的视网膜色素上皮（RPE）细胞移植治疗年龄相关性黄斑变性（AMD）和视网膜色素变性（RP）是近年研究热点,但RPE体外分化诱导效率低下、成本高等一直是难以克服的障碍.研究表明,姜黄素（curcumin）可促进人胚胎干细胞（ESCs）的定向诱导分化,但其对人ESCs向RPE样细胞的定向分化的作用机制尚不清楚. 目的 研究体外培养的人ESCs向视网膜色素上皮（RPE）样细胞的诱导分化过程,探讨curcumin对人ESCs向RPE细胞定向诱导效率的影响及其机制. 方法 将人ESCs株进行体外培养,将处于对数生长期的ESCs传代至基质膜（Matrigel）包被的6孔板中,以mTeSRTM1培养基培养至过渡融合状态后更换为含质量分数87％ KnockOutTM DMEM、质量分数10％血清替代物（SR）、质量分数1％非必需氨基酸和质量分数1％谷氨酰胺及青链霉素双抗的分化诱导体系,同时加入终浓度为1 μmol/L的curcumin处理24 h,对照组培养基中未加入curcumin.分别于诱导培养3周及5周时提取细胞RNA及蛋白,采用荧光定量逆转录PCR（RT-PCR）法检测诱导RPE（iRPE）细胞中干细胞标志物、RPE相关标志物及Wnt/β-catenin信号通路相关因子mRNA的相对表达水平;采用Western blot法及免疫荧光染色检测人ESCs、iRPE细胞及人RPE细胞中相关标志物蛋白的表达水平;通过细胞吞噬实验检测iRPE细胞的吞噬功能. 结果 Curcumin组诱导后3周时即可见iRPE细胞色素化,随着时间延长色素化程度更高,而对照组细胞在诱导后5周时开始出现细胞色素化.RT-PCR结果显示,curcumin诱导后3周及5周,curcumin组iRPE细胞中ESCs标志物NANOG mRNA的相对表达水平明显低于对照组,差异均有统计学意义（t=13.086,P=0.022;t=34.186,P=0.004）,而RPE标志物Pax6、RX、CRALBP及RPE65 mRNA的相对表达量明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）.Western blot检测显示,CRALBP、RPE65和MITF蛋白在iRPE细胞中表达,表达强度与人RPE细胞相近,而人ESCs不表达上述蛋白.免疫荧光染色显示,iRPE细胞中Pax6、MITF和ZO-1蛋白表达阳性,分别定位于细胞质和细胞膜,可见curcumin组得到的细胞为iRPE细胞,纯化效率达到100％,体外细胞吞噬实验显示,iRPE细胞的细胞质内呈现的聚苯乙烯荧光微球接近阳性对照组,而阴性对照组iRPE细胞中未见到聚苯乙烯荧光微球.诱导培养后第3周和第5周时,curcumin组细胞中Wnt信号通路下游靶因子Lef1、MYC和TCF7,Wnt受体FZD3及Wnt配体Wnt2B和Wnt7B的mRNA相对表达水平明显高于对照组,差异均有统计学意义（均P＜0.01）. 结论 Curcumin能提高人ESCs向RPE样细胞的定向诱导效率,其主要机制可能是通过促进Wnt/β-catenin信号通路的活性,从而促进iRPE细胞的分化和成熟。

MiR-200c调节人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的分子机制研究

目的探究miR-200c对人结肠癌SW480细胞侵袭和迁移的影响及其相关机制。方法将SW480细胞分为类似物转染组(转染miR-200c类似物)、抑制物转染组(转染miR-200c核酸抑制剂)、类似物阴性对照组(转染miR-200c类似物的无义序列)、抑制物阴性对照组[加入miR-200c核酸抑制剂的载体(不含miR-200c核酸抑制剂)]以及空白组(不进行任何处理)。实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测12 h和24 h转染效率。细胞划痕实验和transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭。Western blot法检测转染后β-catenin和E-cadherin的表达。结果细胞划痕实验显示,类似物转染组12 h和24 h后伤痕宽度均高于类似物阴性对照组(均P<0.05),抑制物转染组均低于抑制物阴性对照组(均P<0.05)。Transwell实验显示,与类似物阴性对照组和抑制物阴性对照组比较,类似物转染组24 h和48 h通过8μm孔径的细胞数减少,抑制物转染组增多(均P<0.05)。类似物转染组β-catenin和E-cadherin的表达均升高,抑制物转染组各蛋白表达均下降(均P<0.05)。结论 miR-200c可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制SW480细胞的侵袭和迁移。

miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞功能的抑制作用及其机制

背景研究表明miR-375抑制肿瘤细胞的增生、凋亡、迁移和黏附，并对肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）含量的变化进行调控，进而影响血管的生成，但miR-375是否于预视网膜新生血管的形成鲜见报道。目的探讨miR-375对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞（HRCECs）功能的影响及其可能的作用机制。方法用IMDM完全培养液培养HRCECs，并将细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2＋miR-375拟似剂组、CoCl2＋miR-375拟似剂对照组、CoCl2＋miR-375抑制剂组和CoCl2＋miR-375抑制剂对照组，待细胞生长至对数生长期后用200μmol／LCoCl2处理HRCECs以制备缺氧细胞模型；制备终浓度为50nmol／L的miRNA-脂质体复合物和小干扰RNA（siRNA）-脂质体复合物将miR-375和卷曲蛋白4（FZD4）siRNA转染各组细胞48h。采用MTT法检测各组细胞的增生情况（A值）并计算增生倍数；采用Transwell小室法检测各组迁移的细胞数目；采用ELISA法检测细胞培养液中VEGF和血管内皮钙黏蛋白（VE—cadherin）含量；采用实时荧光定量PCR法检测细胞中miR．375mRNA和FZD4mRNA的相对表达量变化；采用Westernblot法分析细胞中Wnt通路相关蛋白的相对表达量变化；采用Matrigel小管形成实验检测细胞的体外形成血管的长度。将培养的细胞分为正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2＋mock组和CoCl2＋FZD4siRNA组，采用荧光素酶报告基因法探测miR-375靶基因FZD4的表达。结果miR-375处理组miR-375mRNA相对表达量明显高于正常对照组，miR-375拟似剂组细胞中miR-375mRNA相对表达量明显高于miR-375拟似剂对照组，miR-375抑制剂组细胞中miR-375mRNA相对表达量明显低于miR-375抑制剂对照组，差异均有统计学意义（t=-19．237、8．764，均P〈0．01），提示miR-375的转染效率较高。正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2＋miR-375拟似剂组、CoCl2＋miR-375拟似剂对照组、CoCl2＋miR-375抑制剂组、CoCl2＋miR．375抑制剂对照组间细胞增生倍数、迁移细胞数、细胞培养液中VEGF和VE—Cadherin含量以及体外小管形成长度的总体比较差异均有统计学意义（F=24．324、26．776、14．113、19．225、15．040，均P〈0．001），CoCl2＋miR-375拟似剂组细胞增生倍数、迁移细胞数体外小管形成长度及细胞分泌VEGF和VE—cadherin量均较CoCl2＋miR-375拟似剂对照组明显减少，而CoCl2＋miR-375抑制剂组较CoCl2＋miR-375抑制剂对照组明显增加，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。正常对照组、CoCl2处理组、CoCl2＋miR-375拟似剂组、CoCl：＋miR-375拟似剂对照组、CoCl2＋miR-375抑制剂组、CoCl2＋miR-375抑制剂对照组细胞中B—catenin、cyclinD1、MMP2和VEGF蛋白表达量的总体比较差异均有统计学意义（F=11．753、13．283、16．770、10．334，均P〈0．001），CoCl2＋miR-375拟似剂组细胞中B．catenin、cyclinDl、MMP2、VEGF蛋白表达量较CoCl2＋miR-375拟似剂对照组均明显下降，CoCl2＋miR-375抑制剂组较CoCl2＋miR-375抑制剂对照组明显增加，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。CoCl，处理组和CoCl2＋mock组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均较正常对照组明显增加，CoCl2＋FZD4siRNA组细胞增生倍数、迁移细胞数和小管形成长度均明显低于CoCl2＋mock组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论miR-375抑制缺氧条件下HRCECs的增生、迁移以及血管形成能力，其作用机制与miR-375直接靶向FZD4调控Wnt通路活性有关。

WNT/β-catenin信号通路与miRNA在乳腺癌发生发展中的作用进展

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,其治疗方式被广泛探索。大量研究表明,异常活化的WNT/β-catenin信号通路和异常表达的miRNA(微小核糖核酸)与乳腺癌的发生发展关系密切。miRNA作为内源性非编码小分子RNA,其可靶向调控WNT/β-catenin信号通路而影响人类多种肿瘤的发生发展。因此,阐明乳腺癌中WNT/β-catenin信号通路的作用机理及miRNA与该通路间的相互作用可能为乳腺癌的治疗提供新的思路。本文就WNT/β-catenin信号通路的组成及其与miRNA在乳腺癌发生发展中的作用进行综述。

雷公藤甲素对K562/G01细胞增殖抑制及Wnt/β-catenin通路相关机制的作用

目的 探讨雷公藤甲素（TP）对耐药慢粒细胞株（K562/G01）增殖抑制和诱导凋亡的作用,同时探讨TP对K562/G01细胞株Wnt/β-catenin信号通路的调控影响.方法 采用10、20、40、80 nmol/L浓度的TP在12、24、48 h三个时间点,作用于伊马替尼耐药的K562/G01细胞株,噻唑蓝法（MTT）检测其对细胞增殖的作用,流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡,实时定量聚合酶链式反应（RT-PCR）检测BCR/ABL融合基因,编码P210蛋白（BCR-ABL）、β-catenin及其下游靶基因Lef-1、cy-clinD1的mRNA表达情况.结果 TP能抑制K562/G01细胞的增殖并诱导其凋亡,该效应呈时间浓度依赖性.其中20、40 nmoL/L的TP处理细胞24 h后,细胞增殖抑制率分别为（22.62±1.33）％、（51.41±1.39）％,晚期凋亡率分别为（6.91±0.14）％、（7.64±0.47）％,定量PCR显示BCR-ABLmRNA表达明显减少;β-catenin及下游靶基因Lef-1、cyclinD1的mRNA同时降低.结论 TP可抑制K562/G01细胞增殖,并诱导其凋亡,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关.

Wnt信号通路与宫颈癌的关系

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一。近年来，由于宫颈细胞学筛查的普及，使宫颈癌得到早期的诊治，其发病病因尚未完全阐述清楚。已知的主要危险因素是高危型HPV（Human papillomaviruse）的感染，但并非所有感染HPV的患者都会发生宫颈癌，