非小细胞肺癌组织LncRNA MIR503HG、Wnt1表达与患者术后5年内生存的相关性

目的 探究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中长链非编码RNA(LncRNA)miR503宿主基因(MIR503HG)、Wnt1表达水平与患者术后5年内生存的关系。方法 纳入108例NSCLC患者,并于术中收集患者肺癌组织和癌旁组织。荧光定量PCR法检测肺癌及癌旁组织中LncRNA MIR503HG、Wnt1 mRNA表达水平;免疫组织化学染色检测肺癌及癌旁组织中Wnt1蛋白表达。对NSCLC患者术后随访5年,记录随访期内生存状况。比较癌旁组织、肺癌组织中LncRNA MIR503HG、Wnt1 mRNA和蛋白阳性表达情况;比较不同结局NSCLC患者肺癌组织中两者表达水平及其在不同临床病理特征中的差异;Pearson法分析肺癌组织中两者表达水平的相关性;Kaplan-Meier生存曲线分析肺癌组织中两者表达水平与患者术后5年内生存的关系;多因素Cox回归分析NSCLC患者术后5年内生存的影响因素;受试者工作特征(ROC)曲线评估肺癌组织LncRNA MIR503HG、Wnt1 mRNA表达水平对患者术后5年内生存的预测价值。结果 肺癌组织中LncRNA MIR503HG表达水平低于癌旁组织,Wnt1 mRNA表达水平和Wnt1蛋白阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05)。低分化、TNM分期Ⅲ期、有淋巴结转移NSCLC患者肺癌组织LncRNA MIR503HG表达水平分别低于中高分化、TNM分期Ⅰ—Ⅱ期、无淋巴结转移NSCLC患者;Wnt1 mRNA表达水平分别高于中高分化、TNM分期Ⅰ—Ⅱ期、无淋巴结转移NSCLC患者(P<0.05)。肺癌组织中LncRNA MIR503HG与Wnt1 mRNA表达水平呈负相关(P<0.05)。108例NSCLC患者术后随访5年,生存48例(生存组),死亡60例(死亡组);LncRNA MIR503HG高表达组、Wnt1 mRNA低表达组术后5年累积生存率分别高于LncRNA MIR503HG低表达组和Wnt1 mRNA高表达组(P<0.05)。与生存组相比,死亡组肺癌组织LncRNA MIR503HG表达水平降低,Wnt1 mRNA表达水平升高(P<0.05)。肺癌组织LncRNA MIR503HG低表达、Wnt1 mRNA高表达、低分化、TNM分期为Ⅲ期、有淋巴结转移均是影响NSCLC患者术后5年内生存的独立危险因素(P<0.05)。肺癌组织LncRNA MIR503HG、Wnt1 mRNA及二者联合预测NSCLC患者术后5年内生存的曲线下面积(AUC)分别为0.823、0.728和0.885,联合预测效能更高(P<0.05)。结论NSCLC患者肺癌组织中LncRNA MIR503HG呈低表达,Wnt1呈高表达,二者与患者临床病理特征和术后5年内生存情况密切相关,对患者术后5年内生存情况有较高预测价值。

Wnt1基因在乳腺癌细胞株MCF-7/ADR中的表达与多柔比星化疗抵抗关系的研究

目的探讨Wnt1在乳腺癌细胞中的表达及其在多柔比星化疗抵抗中的作用。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Wnt1基因在乳腺癌细胞中的表达;双链siRNA转染阻断Wnt1基因,RT-PCR和免疫印迹法(Western blotting)检测基因沉默效果;细胞毒实验(MTT)法检测乳腺癌细胞的生长抑制率。结果对照组、siRNA干扰组、多柔比星处理组,Wnt1沉默MCF-7/ADR+ADM组的细胞存活率分别为(100±5.2)%,(84.3±4.1)%,(68.7±4.7)%和(42.3±3.5)%,其他3组的细胞存活率与对照组比较,差异有统计学意义(F=5.381,P<0.05)。Wnt1沉默MCF-7/ADR+ADM组与其他3组比较细胞的存活率均降低,与对照组、siRNA干扰组和多柔比星处理组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);Wnt1在乳腺癌细胞呈高表达,siRNA沉默Wnt1基因,可以显著下调Wnt1mRNA和蛋白的表达。结论 Wnt1基因在乳腺癌细胞呈高表达,沉默Wnt1基因下调Wnt1基因的转录和翻译,能显著增强乳腺癌细胞对多柔比星的敏感性,部分逆转其对多柔比星的耐药性。

靶向Wnt1的miRNA与circRNA及其靶基因间相互作用的生物信息学分析

为对靶向Wnt1的7种mi RNAs进行circ RNAs及其靶基因的预测,同时分析其与circ RNAs及靶基因间的相互作用,分别采用Starbase及mi RWALK软件,对文献报道的靶向Wnt1基因的let-7e、mi R-21、mi R-34a、mi R-122、mi R-148a、mi R-148b与mi R-152等7种mi RNAs的circ RNAs和对应的靶基因进行生物信息学预测.利用Cytoscape 3.2.1对这7种mi RNAs和预测所得到的circ RNAs及对应的靶基因进行网络分析.并进一步对预测到的靶基因通过DAVID软件进行通路分析.Starbase软件对这7种不同mi RNAs所预测的靶circ RNAs的数量分别为58、15、41、20、28、28、28个.分别比较mi RWALK中7～9个以上软件共有的mi RNAs及其与靶基因的关系,发现CHD7基因是唯一一个在三种不同预测范围内与mi R-21、mi R-148a、mi R-148b和mi R-152等4种mi RNAs相对应的靶基因.CNOT6、NBEA、ZFYVE26与ZDHHC17是在两种不同预测范围内与至少4个mi RNAs相对应的靶基因.在7种mi RNAs所预测靶基因相关的KEGG信号通路中,7～9个软件以上共有的信号通路为Focal adhesion信号通路、MAPK信号通路、Notch信号通路与TGF-beta信号通路.在MAPK信号通路中DUSP1与MRPS35_hsa_circ_001042均分别是与mi R-21、mi R-148a、mi R-148b及mi R-152等4种mi RNAs相互作用的靶基因与circ RNA.本研究对靶向Wnt1的mi RNAs及其相互作用的circ RNAs、靶基因与信号通路等进行了网络分析与预测,为进一步分析它们之间的相互作用奠定了基础.

成骨不全XV型WNT1基因突变影响成骨细胞分化的机制

目的探讨成骨不全(OI)XV型患者中,WNT1 c.110T>C/p.I37T和c.505G>T/p.G169C错义突变对WNT1/β-catenin信号通路影响成骨细胞增殖分化的机制。方法构建野生型WNT1、WNT1c.110T>C突变体、WNT1 c.505G>T突变体、WNT1 c.884C>A突变体(阳性对照)和空质粒(载体,阴性对照)转染成骨前细胞(MC3T3-E1)。MTS法检测WNT1基因突变对细胞活性的影响,实时定量PCR(qPCR)和免疫印迹法(WB)分别检测BMP2和RANKL(成骨细胞和破骨细胞分化标志物)的表达。采用qPCR、WB和免疫荧光(IF)检测成骨细胞中WNT1的m RNA、蛋白表达水平与WNT1/β-catenin信号通路相关的蛋白表达水平。结果转染24 h后,WNT1野生型细胞活性显著高于空载组、c.505G>T及c.884C>A突变组,转染48 h后,c.110T>C和c.505G>T突变细胞活性较WNT1野生型细胞显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与野生型细胞株相比,c.110T>C和c.505G>T突变株中BMP2基因的表达显著水平降低,RANKL基因的表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。WNT1 mRNA在空载组,突变型组和野生型组中的表达量与空载组相比,WNT1在突变型组和野生型组中表达显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。与野生型细胞株相比,突变细胞株中非磷酸化β-catenin及磷酸化GSK-3β的表达水平较野生型显著下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论WNT1 c.110T>C和c.505G>T突变可能通过抑制WNT1/β-catenin信号通路影响成骨细胞增殖和成骨表型,这可能与OI有关。

电穿孔法可用于家蚕基因功能分析

【目的】明确基于电穿孔的基因功能分析方法在家蚕Bombyx mori活体内的应用实效。【方法】针对调控家蚕幼虫体表斑纹黑色素合成的靶基因Wnt1(Wingless),人工合成特异性siRNA,向4龄第3天家蚕幼虫注射Wnt1 siRNA并进行电穿孔作为处理组(ERFA-RNAi),以注射Wnt1 siRNA但未进行电穿孔的幼虫作为阴性对照组(negative control,NC),解剖5龄幼虫斑纹区的表皮,用实时定量RT-PCR测定表皮中Wnt1的相对表达量,验证电穿孔介导的RNAi效果。带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP和红色荧光蛋白报告基因DsRed2表达元件的转座子载体pPIG-A3GR,通过电穿孔导入家蚕2龄幼虫;正常饲养72 h后,用荧光体视显微镜观察幼虫中EGFP和DsRed2的表达,验证当世代家蚕的嵌合体转基因。【结果】家蚕4龄第3天幼虫中导入Wnt1的特异性siRNA后,5龄幼虫体表特定部位斑纹的形成明显受到抑制,实时定量RT-PCR分析表明5龄幼虫表皮中Wnt1的表达水平显著降低。嵌合体转基因家蚕的阳性率达56.60%,并且两个荧光报告基因EGFP和DsRed2在幼虫、蛹及成虫期持续表达。【结论】电穿孔技术可快捷、高效地向家蚕活体内导入外源RNA或DNA,是家蚕乃至其他昆虫基因功能解析的有效方法。

TKTL1和WISP-1在喉癌患者病灶组织中的表达及对预后的影响

目的探究喉癌患者病灶组织中转酮醇酶样基因1(TKTL1)和Wnt1诱导分泌蛋白1(WISP-1)的表达水平,分析其与患者预后的关系。方法选取2016年3月至2018年3月于本院接受治疗的喉鳞状细胞癌患者75例为喉癌组、声带息肉患者68例为对照组,比较两组患者TKTL1和WISP-1的阳性表达率、TKTL1 mRNA表达量、WISP-1蛋白表达水平、血清肿瘤标志物和癌细胞增殖活力,Pearson法分析TKTL1、WISP-1表达与血清肿瘤标志物、癌细胞增殖活力指标的相关性,Kaplan-Meier法分析TKTL1、WISP-1表达与患者预后的关系。结果喉癌组的TKTL1、WISP-1阳性表达率,TKTL1 mRNA、WISP-1蛋白、血清癌胚抗原(CEA)、糖类抗原199(CA199)表达水平,组织中增殖基因信号传导及转录激活因子3(STAT3)、原癌基因c-myc的mRNA表达量均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。TKTL1、WISP-1的表达量与CEA、CA199、STAT3 mRNA和c-myc mRNA表达均呈明显正相关(P<0.05)。TKTL1、WISP-1高表达患者的3年累计生存率明显高于TKTL1、WISP-1低表达患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 TKTL1、WISP-1在喉癌患者病灶组织中呈高表达状态,可促进癌细胞增殖,影响患者的术后生存时间。

长链非编码RNA HCG18对人卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响及其机制

目的探讨长链非编码RNA人类白细胞抗原复合体18(HCG18)对人卵巢癌细胞SKOV3及顺铂耐药细胞SKOV3/DDP耐药性的影响及其作用机制。方法采用RT-PCR检测SKOV3及SKOV3/DDP细胞中HCG18和miR-449的表达水平。采用HCG18 siRNA转染细胞,经12.5μg/ml顺铂处理48 h后,MTT法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡情况及细胞周期,荧光素酶报告基因实验检测HCG18、miR-449和Wnt1基因之间的靶向作用。结果与人正常卵巢上皮细胞NOEC比较,SKOV3中HCG18表达明显增高(P<0.05),而miR-449的表达明显降低(P<0.05)。HCG18 siRNA转染后,顺铂处理后的SKOV3和SKOV3/DDP细胞活性均明显低于对照组(P<0.05),细胞凋亡率和G_(2)/M期细胞占比均明显高于对照组(P<0.05)。miR-449 inhibitor转染SKOV3及SKOV3/DDP细胞后,HCG18 siRNA对细胞活性、凋亡和细胞周期的不利影响均被部分逆转(P<0.05)。荧光素酶报告基因实验结果显示,HCG18可靶向结合miR-449的3'-UTR区,miR-449可靶向结合Wnt1基因的3'-UTR区。转染HCG18 siRNA可明显上调miR-449的表达水平(P<0.05)。单独转染HCG18 siRNA或miR-449 mimic均可明显下调Wnt1的mRNA表达水平(P<0.05)。结论下调HCG18可通过miR-449/Wnt1信号通路抑制人卵巢癌细胞活性,促进癌细胞凋亡,诱导细胞周期G_(2)/M期阻滞,进而提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。

基于CRISPR/Cas9系统分析草地贪夜蛾Wnt1基因的生物学功能

为明确草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda中Wnt1基因的生物学功能,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)技术检测草地贪夜蛾胚胎发育期Wnt1基因的表达谱,利用CRISPR/Cas9系统对Wnt1基因进行定向敲除,并通过qPCR技术检测草地贪夜蛾Wnt1基因缺失突变体中与昆虫发育相关基因的表达水平。结果显示,Wnt1基因在草地贪夜蛾整个胚胎发育期均有表达,在胚胎发育早期(6 h)表达水平最高。将SfWnt1-sgRNA和Cas9蛋白混合注入草地贪夜蛾卵中,胚胎死亡率明显升高,同时获得了Wnt1基因缺失的草地贪夜蛾突变体。突变率与注射浓度相关,注射浓度越高,突变率越高;当SfWnt1-sgRNA和Cas9蛋白混合后终浓度均为300 ng/μL时,注射的724粒卵中获得体节缺陷突变体52头,附肢缺陷突变体64头,组织特化突变体20头;SfWnt1-sg RNA和Cas9蛋白混合后终浓度均为100 ng/μL时,注射的413粒卵中最终获得体节缺陷突变体14头,附肢缺陷突变体22头,组织特化突变体7头;这些突变体均无法存活至化蛹。草地贪夜蛾Wnt1基因被敲除后,与昆虫发育密切相关的17个基因表达水平均显著下调。表明Wnt1基因在草地贪夜蛾胚胎发育过程中发挥着至关重要的作用。

VAP患者WISP1/TLR4/整合素β5通路基因及相关炎性因子的表达

目的 探究Wnt1-诱导的信号通路蛋白1(WISP1)/Toll样受体4(TLR4)/整合素β5通路基因及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-8在呼吸机相关性肺炎(VAP)患者中的表达。方法 选取2018年4月-2021年3月绍兴市人民医院收治的120例VAP患者(VAP组)及60例机械通气非VAP患者(对照组),统计VAP患者病原菌分布;比较两组外周血单个核细胞WISP1、TLR4、整合素β5 mRNA相对表达量及血清TNF-α、IL-6、IL-8水平;绘制受试者工作特征曲线(ROC)分析相关指标预测VAP患者28 d死亡的临床价值。结果 120例患者分离出156株病原菌,革兰阴性菌、革兰阳性菌、真菌分别占51.92%、36.54%、11.54%。VAP组外周血单个核细胞中WISP1、TLR4、整合素β5相对表达量以及血清TNF-α、IL-6、IL-8表达水平较对照组均升高(P<0.05)。VAP组死亡患者外周血单个核细胞中WISP1、TLR4 mRNA相对表达量以及血清TNF-α、IL-6表达水平较存活组均升高(P<0.05)。WISP1 mRNA、TLR4 mRNA、TNF-α、IL-6预测VAP患者28 d死亡的ROC曲线下面积分别为0.886、0.795、0.644、0.876。结论 VAP患者WISP1/TLR4/整合素β5通路激活及相关炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8水平升高,WISP1 mRNA、TLR4 mRNA、TNF-α、IL-6对VAP患者预后有一定预测价值。