人源WNT16 HEK 293T稳转细胞株构建、蛋白纯化与活性检测方法研究

目的无翅型MMTV整合位点家族成员16(WNT16)是一种重要的信号调节蛋白,参与多种细胞生物学过程的调控。本研究旨在构建稳定转染WNT16基因的HEK 293T细胞株,并利用多聚赖氨酸标签(HIS-Tag)实现高效纯化WNT16蛋白。方法使用TK-PCDH-copGFP-T2A-Puro载体,将WNT16 CDS-HIS序列通过XbaI和BamHI位点连接载体,构建慢病毒载体质粒;将该质粒与pSPAX2和pMD2.G一起共转染HEK 293T细胞,制备携带WNT16基因的慢病毒;利用慢病毒感染HEK 293T细胞,并通过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定稳定过表达WNT16的细胞株;利用镍螯合琼脂糖凝胶与HIS标签的高亲和性纯化WNT16蛋白,使用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测纯化效果;用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,使用Western Blot法检测Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,以评估WNT16蛋白的活性。结果成功构建过表达WNT16基因的慢病毒表达载体,并用其感染HEK 293T细胞。经过嘌呤霉素筛选和Western Blot鉴定,我们获得了稳定表达WNT16的HEK 293T细胞株。使用HIS标签成功纯化了WNT16蛋白,并用考马斯亮蓝染色和Western Blot法检测了纯化效果。最后,我们用纯化的WNT16蛋白刺激Jurkat细胞,并用Western Blot法检测了Jurkat细胞中β-catenin信号通路蛋白的水平,WNT16蛋白能够显著增加Jurkat细胞中β-catenin蛋白的表达,表明纯化的WNT16蛋白具有激活WNT/β-catenin通路的生物学活性。结论本研究成功实现了WNT16蛋白的高效表达和纯化,并初步研究了其功能。这为进一步探究WNT16在细胞生物学中的作用提供了重要的实验基础。

雌激素对去卵巢大鼠骨组织Wnt16、β-catenin、OPG、RANKL表达的影响

目的研究雌激素对去卵巢大鼠骨组织中Wnt16、β-catenin、OPG、RANKL表达的影响,探讨雌激素对骨组织的保护作用。方法选取3月龄Wistar雌性大鼠40只,随机分为假手术组、去势组、实验组1和实验组2。两组实验组分别给予17β-雌二醇皮下注射4周和16周,其余两组给予等量0.9%氯化钠溶液。16周后测定骨组织中Wnt16、OPG、RANKL、β-catenin表达量,HE染色分析大鼠胫骨平台处骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)和骨小梁间距(Tb.SP)变化,ELISA法测定血清雌二醇(E_2)水平。结果假手术组、实验组2与去势组比较,OPG、β-catenin、Wnt16 m RNA、血清E_2水平、Tb.Th和Tb.N明显升高,RANKL水平和Tb.SP明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。实验组1与去势组相比,β-catenin、血清E_2水平、Tb.Th和Tb.N明显升高,RANKL水平和Tb.SP明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论雌激素可能通过上调Wnt16、β-catenin、OPG表达,下调RANKL表达,来预防骨质疏松。

WNT16B对体外培养宫骶韧带成纤维细胞增殖和胶原分泌的影响

目的研究WNT家族分泌型糖蛋白WNT16B对体外培养宫骶韧带成纤维细胞增殖和胶原蛋白分泌的影响,从分子水平解析盆腔器官脱垂(POP)的发病机制。方法选择2018年10月至2021年6月北京协和医院收治的4例POP患者,按POP定量(POP-Q)分度法均≥Ⅲ度;选择非POP的妇科良性疾病患者2例作为对照。取宫骶韧带组织标本进行韧带成纤维细胞的原代培养;构建WNT16B过表达载体并转染原代培养的成纤维细胞;RT-PCR法检测成纤维细胞WNT16B和I型胶原蛋白mRNA的表达水平;实时无标记细胞分析系统检测细胞增殖活性。结果POP患者宫骶韧带成纤维细胞WNT16B mRNA的表达水平显著低于非POP对照患者(P<0.001)。过表达WNT16B载体转染POP患者原代成纤维细胞后,细胞倍增时间显著缩短(P<0.05),I型胶原蛋白的mRNA表达水平显著提高(P<0.05)。结论POP患者宫骶韧带成纤维细胞中WNT16B表达水平低,可能导致细胞的生长增殖活性被抑制以及分泌胶原的能力下降,从而引发POP的疾病进展;WNT16B可能是POP的潜在保护因素之一。

基于WNT16预防骨质疏松非椎体骨折的研究进展

随着我国老龄化程度加深,骨质疏松发病率持续升高,已经严重威胁我国国民健康。骨折作为骨质疏松最严重的并发症,是骨质疏松患者死亡的主要原因。近年来,关于骨质疏松骨折的研究有很多,但偏重于骨质疏松椎体骨折,而骨质疏松非椎体骨折的研究较少。目前,市场上预防骨质疏松的药物也往往针对椎体骨折,而骨质疏松非椎体骨折的可用药物较少。WNT信号通路在预防骨质疏松骨折方面的研究较多,WNT16作为WNT家族中新成员,是调控骨皮质的关键因子,骨质疏松非椎体骨折的关键原因在于骨皮质变薄,因此,WNT16可能是预防非椎体骨折的潜在靶标。本文主要通过总结近期关于WNT16在骨质疏松骨折上的研究,探讨WNT16在骨质疏松非椎体骨折的预防上所起的作用,为临床预防骨质疏松非椎体骨折提供参考,以及为骨质疏松非椎体骨折药物开发提供新思路。

利用DNA免疫技术制备WNT16蛋白多克隆抗体

Wnt16属于非经典wnt信号途径上的一员,目前有大量的研究表明wnt16与胚胎的血液发育和骨骼发育相关。为了阐明wnt16在造血过程中的调控机制,利用RT-PCR(逆转录PCR)扩增斑马鱼wnt16基因的ORF(开放阅读框)序列全长,构建真核表达载体pCAGGS-P7/wnt16,测序正确后,用该表达载体免疫BALB/c雌鼠,进行DNA免疫,制备斑马鱼抗WNT16特异性多克隆抗体。结果表明:通过DNA免疫制备的斑马鱼抗WNT16抗血清能特异性识别WNT16蛋白。斑马鱼WNT16抗体成功制备为进一步的功能研究奠定了重要基础。