Wnt2与Dvl蛋白在食管鳞癌组织中的表达及临床意义

目的检测Wnt2与散乱(Dvl)蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况,探讨其与食管鳞癌发生发展的关系。方法采用Western blot法分别检测Wnt2、Dvl蛋白在60例食管鳞癌组织及其对应癌旁组织中的表达,并分析其与临床病理特征之间的关系。结果 Wnt2和Dvl蛋白在食管鳞癌组织中的相对表达量(0.512±0.406和1.218±1.082)高于癌旁食管组织(0.153±0.189和0.505±0.358),且Wnt2及Dvl蛋白表达在不同浸润深度、TNM分期及淋巴结转移情况中存在差异(P<0.01);Wnt2与Dvl蛋白在食管鳞癌组织中的表达呈正相关(r=0.718,P<0.01)。结论 Wnt2、Dvl蛋白的高表达通过Wnt2信号转导通路协同促进食管鳞癌的发生、发展及浸润转移。

microRNA-21靶向调控Wnt2基因对肝癌细胞HepG2增殖与迁移的影响

目的探讨分析microRNA-21(miR-21)靶向调控Wnt2基因对肝癌细胞HepG2增殖与迁移的影响。方法采用实时荧光定量PCR法检测肝癌细胞HepG2及正常肝细胞株LO2 miR-21的表达情况。对HepG2细胞转染miR-21抑制剂,分析转染后抑制剂组与对照组miR-21的表达情况、细胞增殖、迁移及凋亡情况,检测两组细胞Wnt2蛋白表达水平,并采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与Wnt2基因的关系。计量资料两组间比较采用t检验。结果HepG2细胞miR-21相对表达水平明显高于LO2细胞(1.978±0.035 vs 1.586±0.022,t=16.424,P<0.05)。转染miR-21抑制剂后,抑制剂组miR-21相对表达水平较对照组显著降低(0.857±0.017 vs 1.684±0.039,t=33.669,P<0.05)。转染miR-21抑制剂24、48、72 h后,抑制剂组HepG2细胞增殖能力均较对照组显著降低(P值均<0.05);抑制剂组穿过Tranwell小室的细胞数显著低于对照组(83.72±15.06 vs 147.85±20.64,t=4.347,P<0.05);抑制剂组细胞凋亡率明显高于对照组(25.67%±3.95%vs 10.27%±2.14%,t=5.937,P<0.05)。抑制剂组HepG2细胞的Wnt2相对表达水平明显低于对照组(0.862±0.127 vs 1.306±0.218,t=3.048,P<0.05)。TargetScan软件显示,miR-21抑制剂可显著抑制野生型Wnt2-3′UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性(0.972±0.102 vs 0.612±0.092,t=4.219,P<0.05),而对突变型Wnt2-3′UTR质粒转染细胞的荧光素酶活性并无明显影响(0.982±0.093 vs 0.911±0.128,t=0.972,P>0.05)。结论抑制miR-21表达可有效抑制HepG2细胞增殖和迁移,促进HepG2细胞凋亡,并抑制Wnt信号通路的过度激活,可能成为肝癌治疗的潜在靶基因之一。

wnt2与肿瘤的研究进展

wnt信号通路是一条在进化上高度保守的通路，对细胞的增殖、迁移和凋亡起重要作用，wnt信号通路的失调与许多疾病的病理改变甚至肿瘤的发生密切相关。目前发现的人类wnt基因共有19种，它们有不同的表达形式和功能日。其中发现wnt2在多种肿瘤组织中高表达，且能促进肿瘤细胞的生长迁移，包括胰腺癌、胃癌、直肠结肠癌、胶质细胞瘤等。本文重点就wnt2与多种肿瘤之间关系的研究进展进行综述。

蓬乱蛋白2干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在hUVECs中的表达

目的获得蓬乱蛋白2(DVL2)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并在人脐静脉内皮细胞中(h UVECs)稳定表达。方法 (1)聚合酶链反应扩增目的基因,设计合成sh RNA,以慢病毒表达质粒为基础构建DVL2干扰和过表达载体,酶切电泳、实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)和测序技术鉴定载体构建是否成功;(2)以3质粒系统在HEK293T细胞中包装病毒,通过荧光显微镜观察计数并计算病毒滴度;以嘌呤霉素筛选稳定转染的h UVECs,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为BC组(h UVECs空白对照)、NC组(HBLV-GFP-PURO阴性对照)、干扰组(pHB-shRNA-HDVL2)及过表达组(pHBLV-HDVL2)。(3)通过q RT-PCR与Western blotting检测分别从m RNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果 (1)插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。干扰序列峰形图为单峰,无突变。(2)病毒包装后,NC组、干扰组、过表达组滴度分别为2×108、2×108和1×108 TU/ml,感染人脐静脉内皮细胞的感染效率达98%。(3)干扰组DVL2的表达较BC组降低,差异有统计学意义(P <0.05),过表达组较BC组升高,差异有统计学意义(P <0.05),其中干扰效率为61%,蛋白质过表达水平为BC组的2.7倍。结论 DVL2基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在原代h UVECs中稳定表达。

Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌发生中的分子机制研究

目的探讨Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌细胞增殖、迁移方面的影响和其在肝癌发生发展中的可能作用。方法体外培养HepG2和L02细胞,采用免疫荧光和Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin、GSK3β、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平。培养的HepG2细胞分别用浓度100ng/ml的Wnt3α和20 ng/ml的DKK1处理,采用CCK-8检测细胞增殖活力,流式细胞实验检测细胞周期,Western Blot检测β-catenin、GSK3β、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平,Trans-well检测HepG2的迁移情况。结果与正常肝细胞L02相比,HepG2细胞高表达β-catenin,cyclin D1和c-myc,低表达GSK3β。Wnt3α能够显著促进HepG2细胞的增殖活力,而DKK1能够显著抑制其增殖。与Wnt3α组相比,DKK1处理组细胞G0/G1期细胞比例增加,(68.6±0.5)%VS(47.5±1.5)%(P<0.01),而S期细胞比例减少(17.4±0.5)%VS(28.6±0.5)%,(P<0.01)。Western Blot检测结果说明,Wnt3α提高了β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达水平,抑制了GSK3β的表达,而DKK1抑制了β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达。迁移实验透膜细胞数对照组为(176.40±12.98)、Wnt3α组为(238.20±18.38)、DKK1组为(110.40±9.46),P<0.05。结论 Wnt/β-catenin信号通路在促进HepG2细胞的增殖和迁移方面起重要作用,在肝癌的发生发展和转移中起着重要的作用,是肝癌发生的重要分子机制。

RNA干扰敲低Wnt2的表达抑制U251细胞生长的体内外研究

目的 在体内外研究转染靶向Wnt2的siRNA对U251细胞的抑制效果.方法 向U251细胞转染靶向Wnt2的siRNA后,免疫印记检测转染后Wnt2及相关蛋白表达,MTT检测细胞增殖,annexin标记细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞周期分布,鼠尾胶3D生长实验检测细胞侵袭能力的变化.建立裸鼠胶质瘤皮下动物模型,瘤内注射Wnt2 siRNA观察肿瘤生长情况.结果 转染Wnt2siRNA后,U251细胞的Wnt2、frizzled2、磷酸化GSK-3β、β-catenin等表达降低,细胞增殖受抑,凋亡率升高,细胞阻滞于G0/G1期.体内研究发现转染靶向Wnt2的siRNA后,裸鼠皮下肿瘤的生长速度缓慢,相应的蛋白表达降低.结论 转染靶向Wnt2的siRNA可有效敲低该基因在U251细胞内的表达,从而抑制了胶质瘤细胞生长,具有潜在的治疗前景.

Wnt2在乳腺癌患者中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭力的影响

目的 :探讨Wnt2在乳腺癌患者中的表达及其对乳腺癌细胞侵袭力的影响。方法 :ELISA法检测健康志愿者和乳腺癌患者血清中Wnt2的含量;免疫组织化学法检测乳腺癌组织及其相应癌旁组织中Wnt2的表达。分别取Wnt2高表达和Wnt2低表达的乳腺癌组织进行原代细胞培养,应用Transwell小室法和细胞黏附实验检测2种乳腺癌细胞的侵袭能力和黏附能力。结果 :乳腺癌患者血清中Wnt2的含量明显高于健康志愿者(P<0.05),乳腺癌组织中Wnt2的阳性表达率明显高于其相应的癌旁组织(P<0.01)。Wnt2高表达的乳腺癌细胞的侵袭能力和黏附率均高于Wnt2低表达的乳腺癌细胞(P值均<0.05)。结论 :乳腺癌组织中Wnt2高表达,Wnt2高表达的乳腺癌细胞侵袭能力较强。

miR-598靶向下调Wnt2b抑制肝癌细胞增殖并诱导凋亡

目的探讨miR-598对肝癌细胞增殖和凋亡的影响及作用机制。方法采用qRT-PCR检测肝癌组织和肝癌细胞SNU-449、Huh7、HCCLM3及正常肝细胞L-02中miR-598表达水平。在Huh7细胞中转染miR-598mimics,分为空白对照组、miR-NC组、miR-598组、miR-NC+吉非替尼(2.5μmol·L^(-1))组和miR-598+吉非替尼组。CCK-8法检测细胞增殖,平板细胞克隆实验检测细胞克隆能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测Bax、Bcl-2和Wnt2b蛋白表达,荧光素酶报告系统鉴定miR-598和Wnt2b靶向关系。共转染miR-598 mimics、pcDNA3.1-Wnt2b,分为空白对照组、miR-598+吉非替尼+NC组和miR-598+吉非替尼+Wnt2b组,观察细胞增殖、克隆、凋亡变化。结果肝癌细胞SNU-449、Huh7、HCCLM3中miR-598表达水平低于正常肝细胞L-02(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-598组和miR-NC+吉非替尼组细胞存活率低,克隆形成数目少,细胞凋亡率高,Bax蛋白表达水平增加,Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。与miR-598组和miR-NC+吉非替尼组比较,miR-598+吉非替尼组细胞存活率降低,克隆形成数目减少,细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平增加,Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。miR-598靶向下调Huh7细胞中Wnt2b表达水平。miR-598+吉非替尼+Wnt2b组较miR-598+吉非替尼+NC组的细胞存活率高,克隆形成数目多,细胞凋亡率低,Bax蛋白表达水平低,Bcl-2、Wnt2b蛋白表达水平高(P<0.05)。结论 miR-598可抑制Huh7细胞增殖并诱导凋亡,可能通过靶向下调Wnt2b表达,提高Huh7细胞对吉非替尼的敏感性。

Wnt信号通路激活在肝门部胆管癌发生中的作用

目的探讨Wnt信号通路激活在肝门部胆管癌发生中的作用。方法回顾性分析1998年7月至2007年5月在中山大学附属第一医院行手术切除治疗的129例肝门部胆管癌及45例先天性胆总管囊肿患者临床资料。其中肝门部胆管癌患者男91例,女38例;平均年龄(56±23)岁。先天性胆总管囊肿患者男32例,女13例;年龄(39±11)岁。所有患者均签署知情同意书,符合医学伦理学规定。制作患者病理标本的组织芯片,对Wnt信号蛋白(Wnt)-2、β-链蛋白(β-catenin)、T细胞因子-4(TCF-4)蛋白进行免疫组化染色。以Wnt-2、β-catenin和TCF-4 3个指标同时阳性表达为Wnt信号通路激活。两组率的比较采用χ2检验。结果免疫组织染色结果显示,肝门部胆管癌组织Wnt-2阳性表现为细胞浆出现棕黄色颗粒,β-catenin、TCF-4阳性表现为细胞核出现棕黄色颗粒。肝门部胆管癌组织中Wnt-2、β-catenin和TCF-4 3个指标同时阳性表达的发生率为54%(70/129),明显高于先天性胆管囊肿的29%(13/45)(χ2=11.2,P<0.05)。结论 Wnt信号通路激活可能是肝门部胆管癌发生的重要分子生物学机制之一。