胚胎期Wnt3a基因特异性敲降对小鼠大脑神经发生的影响

目的 研究胚胎期第13天(E13)特异性敲降Wnt3a基因对小鼠大脑神经发生的影响。方法 利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证Wnt3a在脑皮质神经干细胞中的敲降率。通过子宫内电穿孔实验在E13时将Wnt3a-shRNA质粒电转到胎鼠大脑皮质中,从而下调Wnt3a在脑皮质神经干细胞中的表达。在E16时收取小鼠脑组织,进行免疫荧光染色检测,观察下调Wnt3a后小鼠脑组织中神经元发育进程的改变。结果 RT-qPCR结果显示,神经干细胞中Wnt3a敲降后其mRNA表达水平降低54%,与对照组相比差异具有统计学意义(t=11.260,P<0.001)。免疫荧光染色结果显示,Wnt3a下调导致大脑皮质的皮质板(CP)中的绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞比例降低,大脑中间带(IZ)的GFP阳性细胞比例上升,差异均具有统计学意义(t=4.400、4.482,P<0.01)。结论 E13时特异性下调小鼠脑中Wnt3a基因导致GFP荧光分布异常,神经发生过程受到干扰。

R脊椎蛋白1协同Wnt3A通过Wnt／β-联蛋白信号通路促进成骨细胞分化

目的探究R脊椎蛋白1（RSPO1）在成骨分化中的作用及机制。方法利用xCELLigence系统研究RSPO1对C2C12细胞增殖及细胞活力的影响。通过磷酸酶检测试剂盒检测ALP活性，ELISA法检测护骨因子的表达，通过双荧光素酶报告基因检测系统，利用TOPflash T细胞因子（TCF）报告质粒检测Wnt/β-联蛋白（β-catenin）信号通路活性。利用蛋白印迹法检测β-catenin蛋白累积情况。采用t检验进行统计学分析。结果RSPO1对C2C12细胞增殖及细胞活力无影响。RSPO1单独处理上调ALP活力（2.85±0.08和1.74±0.21，t=3.014，P〈0.05）及护骨因子表达能力（1.29±0.13和1.0±0.21，t=3.348，P〈0.05）较弱，而RSPO1及Wnt3A协同处理可显著增强ALP活力（81.37±5.08和1.74±0.21，t=31.31，P〈0.01）并上调护骨因子表达（5.26±0.60和1.00±0.21，t=6.99，P〈0.01）。RSPO1协同Wnt3A激活TCF活性并诱导β-catenin蛋白积累（3.28±0.18和1.00±0.21，t=10.94，P〈0.05）。但是，单独RSPO1对TCF的活性及β-catenin积累无影响（1.25±0.08和1.0±0.21，t=2.225，P〉0.05）。结论RSPO1可协同Wnt3A激活Wnt/β-catenin信号通路，诱导细胞成骨分化，提示RSPO1有望应用于RA的治疗。

Wnt3a促进人晶状体上皮细胞上皮间充质转化的研究

目的研究Wnt3a促进人晶状体上皮细胞上皮间充质转化的作用，并探讨相关分子机制。方法实验研究。构建Wnt3acDNA表达载体，采用脂质体介导转染技术将Wnt3acDNA表达载体瞬时转染人人晶状体上皮细胞系SRAOI／04细胞中，对照组转入pcDNA3-HA表达载体，蛋门印迹法测定验证过表达效果；蛋白印迹法及免疫荧光染色检测晶状体上皮细胞中B—catenin的表达和定位变化，以及细胞上皮表型标记物E—cadherin和间质表型标记物纤维连接蛋白的表达；体外划痕实验及Transwell小室迁移实验检测Wnt3a过表达对SRAOI／04细胞的迁移运动能力的影响。组间计量资料的比较，采用Student’st检验分析。结果通过构建人Wnt3acDNA表达载体获得Wnt3a过表达的wnt3a／sRA01／04细胞及对照pcDNA3-HA／SRAOI／04细胞。Wnt3a过表达促使SRAOI／04细胞内的B—catenin细胞定位由胞质转人胞核；使晶状体上皮细胞发生上皮间充质转化（上皮表型E—cadhefin表达降低，间质表型纤维连接蛋白表达升高）。体外划痕试验中划痕24h后测得wnt3a／sRA01／04细胞的迁移距离是（0．36±0．02）mm，明显高于对照组（t=21．98，P〈0．01）；Transwell小室迁移试验中48h后穿过聚碳酸酯膜的wnt3a／SRA01／04细胞数为（92．25±10．34）个，明显多于对照组（t=10．40，P〈0．01），证明wnt3a／sRA0104细胞的运动迁移能力大大增强。结论在人品状体上皮细胞SRA01／04中，Wnt3a过表达使Wnt／β-catenin信号通路活化，诱导细胞发生上皮间充质转化，增强运动迁移能力。