提升上清液Wnt3a蛋白含量的L-Wnt3a细胞培养体系及其促进多能干细胞诱导黑素细胞分化的效应研究

目的:明确L-Wnt3a条件培养基的收集方案并标定Wnt3a蛋白浓度,验证其作为多能干细胞向黑素细胞分化体系中Wnt3a来源的作用。方法:通过观察L-Wnt3a细胞的生长特性及其分泌Wnt3a蛋白量特点,设定收集条件培养基的参数,使用ELISA法对收集到的条件培养基进行Wnt3a蛋白浓度的标定,配制出明确Wnt3a浓度的黑素细胞分化培养基,对胚胎干细胞株WA09及诱导多能干细胞株WTC-11细胞进行黑素细胞的悬浮诱导分化,对获得的诱导黑素细胞进行黑素相关基因表达检测及Masson-Fontana染色等相关验证。结果:优化后的L-Wnt3a条件培养基收集体系能够稳定高效获取Wnt3a蛋白,明确Wnt3a浓度的分化体系能够使WA09和WTC-11成功诱导黑素细胞,使用相应浓度的Wnt3a重组蛋白也能够达到相似的效果。结论:通过优化收集方案能够高效获得明确浓度的L-Wnt3a条件培养基,将其应用于明确Wnt3a浓度的培养体系能够成功诱导多能干细胞分化为功能性黑素细胞。

全身振动训练对骨质疏松大鼠股骨生物力学与Wnt3a蛋白表达的影响

目的探讨全身振动训练对股骨组织生物力学与Wnt3a蛋白表达的影响。方法取雌性SD大鼠48只,随机分为假手术组、骨质疏松组与全身振动组,每组16只。采用Micro-CT检测骨形态计量学参数,三点弯实验检测骨结构力学参数与材料力学参数,Western blotting检测Wnt3a、β-catenin蛋白表达量,qRT-PCR检测Wnt3a、β-catenin、cyclin D1、Tcf1基因表达量。结果与假手术组相比较,骨质疏松组骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度及皮质骨厚度均降低,骨小梁间隙升高;与骨质疏松组比较,全身振动组骨密度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度及皮质骨厚度均升高,骨小梁间隙降低。与假手术组比较,骨质疏松组最大载荷、弹性载荷、最大挠度降低;与骨质疏松组比较,全身振动组最大载荷、弹性载荷、最大挠度升高。与假手术组比较,骨质疏松组最大应力、弹性应力、最大应变和弹性模量降低;与骨质疏松组比较,全身振动组弹性应力、最大应变和弹性模量升高。与假手术组比较,骨质疏松组Wnt3a、β-catenin蛋白及基因表达降低,cyclin D1、Tcf1基因表达量降低;与骨质疏松组比较,全身振动组Wnt3a、β-catenin蛋白及基因表达升高,cyclin D1、Tcf1基因表达量升高。结论全身振动训练可改善骨质疏松大鼠股骨生物力学性能,提高其Wnt3a蛋白表达。研究结果为全身振动训练防治骨质疏松提供了实验室参考数据。

电针对膝关节骨性关节炎大鼠关节软骨中Wnt3a、β-catenin蛋白表达的影响

目的:观察电针对膝关节骨性关节炎大鼠关节软骨内Wnt3a、β-catenin蛋白表达的影响。方法:32只清洁级健康雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、DKK1组和电针组,用4%木瓜蛋白酶诱导大鼠膝关节骨性关节炎模型,分别于造模成功后5周和7周取材,观察大鼠膝关节软骨形态变化以及Western Blot法检测大鼠关节软骨中Wnt3a、β-catenin含量的变化。结果:正常组大鼠在5周和7周时,关节软骨内Wnt3a蛋白呈低表达,分别为0.233±0.04和0.193±0.03;而各造模组大鼠,在这两个时间点,关节软骨内Wnt3a蛋白含量均有不同程度的升高,其中电针组、DKK1组均较模型组有所降低,且具有统计学意义(P<0.05),而此两组间比较无差异(P>0.05)。正常组大鼠在5周和7周时,关节软骨内β-catenin蛋白呈低表达,分别为0.163±0.04和0.143±0.03;而各造模组大鼠,在这两个时间点,关节软骨内β-catenin蛋白含量均有不同程度的升高,其中电针组、DKK1组均较模型组有所降低,且具有统计学意义(P<0.05),而此两组间比较无差异(P>0.05)。结论:电针可能是通过下调Wnt3a、β-catenin蛋白表达、抑制Wnt信号通路,进而保护受损的关节软骨,改善膝关节骨性关节炎大鼠的关节结构和功能状态。

丁苯酞对阿尔茨海默病模型大鼠海马CA1区Wnt3a及β-连环蛋白表达的影响

目的观察丁苯酞(dl-3-n-butylphthalidle)软胶囊对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)模型大鼠海马CA1区Wnt3a蛋白及β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响,探寻丁苯酞发挥脑保护作用的可能机制。方法将72只雄性SD大鼠按随机数字表法分为假手术组(Sham组)、AD模型组(AD组)、丁苯酞治疗组(丁苯酞组)。向双侧海马区注射β-淀粉样蛋白1-42(beta-amyloid people 1-42,Aβ1-42)制作AD模型,Sham组注射5μL 0.9%氯化钠溶液。造模成功后4周,丁苯酞组给予丁苯酞与食用油混合后制成的丁苯酞混合溶液灌胃;Sham组和AD组采用同等剂量的食用油进行灌胃。采用免疫组织化学法和蛋白质印迹法分别于给药后1、2、4和8周检测海马CA1区Wnt3a及β-catenin表达情况。结果蛋白质印迹法表明与Sham组给药后1、2、4和8周[(3 845.25±52.35),(4 385.06±108.85),(9 392.19±81.07),(6 833.15±76.03)]相比,AD组各时间点Wnt3a蛋白表达量增多[(5 595.54±94.60),(7 223.89±86.73),(13 671.83±312.38),(11 641.04±203.65),均P<0.01];各时间点β-catenin蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。与AD组[(4 132.90±79.63),(4 758.74±155.14),(5 188.92±111.82),(5 912.07±83.26)]相比,丁苯酞组各时间点Wnt3a蛋白[(6 261.26±206.51),(8 427.83±293.61),(16 469.74±204.55),(13 438.21±12 399.19)]、β-catenin蛋白表达量明显增多[(5 569.53±96.52),(7 127.78±69.64),(11 454.94±396.43),(9 937.91±157.87),均P<0.01]。免疫组织化学法和蛋白质印迹法检测结果相同。结论丁苯酞可通过上调Wnt3a及β-catenin蛋白的表达,发挥对AD模型大鼠的脑保护作用。

Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠干预效果及作用机制

目的研究Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠的干预效果及作用机制。方法选取30只清洁级SD雄性大鼠,10只为正常组,其余20只建立脑梗死模型,成功18只,随机分为模型组、Wnt3a溶剂组,各9只。Wnt3a溶剂组大鼠给予50 ng/ml Wnt3a重组蛋白腹腔缓慢注射6μl,正常组和模型组给予等体积的生理盐水,三组连续干预1 w。检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β水平,评估神经功能,观察脑组织病理学及脑梗死体积,检测Wnt3a、β-catenin蛋白。结果与正常组相比,模型组、Wnt3a溶剂组SOD、GSH、神经功能评分降低,MDA、TNF-α、IL-1β水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,Wnt3a溶剂组SOD、GSH水平升高,MDA、TNF-α、IL-1β水平降低,脑梗死体积减小,神经功能评分升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组相比,模型组、Wnt3a溶剂组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比,Wnt3a溶剂组Wnt3a、β-catenin蛋白相对表达量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Wnt3a重组蛋白溶剂对脑梗死模型大鼠干预效果显著,能抑制其氧化应激、炎症反应,减少脑梗死体积,提高神经功能,其作用机制可能与Wnt3a/β-catenin信号通路有关。

雌激素介导下Wnt/β-catenin信号通路调控人牙周膜干细胞的成骨分化

背景:已有实验发现,雌激素能促进人牙周膜干细胞骨向分化,但雌激素调控人牙周膜干细胞成骨分化的具体机制目前尚未明确。目的:探讨雌激素通过Wnt/β-catenin信号通路对人牙周膜干细胞骨向分化的调控作用。方法:采用消化组织块法联合有限稀释克隆法分离培养并纯化得到人牙周膜干细胞,取第3代人牙周膜干细胞随机分为3组:单纯成骨诱导液组(对照组);含1×10^(-7)mol/L雌激素成骨诱导液组(雌激素组);含100μg/L Wnt3a成骨诱导液组(Wnt3a组)。各组在成骨诱导1,3,5,7 d时检测碱性磷酸酶活性,成骨诱导7 d时采用Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、GSK-3β、P-GSK-3β、CyclinD1以及成骨相关蛋白Runx-2、OCN的表达水平。结果与结论:(1)各组碱性磷酸酶活性随时间推移均呈上升趋势。雌激素组和Wnt3a组在诱导1,3,5,7 d各时间点碱性磷酸酶表达水平均高于对照组(P<0.05);而雌激素组和Wnt3a组表达水平差异无显著性意义(P>0.05);(2)雌激素组和Wnt3a组β-catenin、P-GSK-3β、CyclinD1的表达水平高于对照组(P<0.05),而GSK-3β表达水平低于对照组(P<0.05),同时雌激素组和Wnt3a组的成骨中晚期标志物Runx2、OCN表达水平均高于对照组(P<0.05)。雌激素组和Wnt3a组间Wnt/β-catenin信号通路相关因子和成骨中晚期相关蛋白的表达差异无显著性意义(P>0.05);(3)结果表明,雌激素可促进人牙周膜干细胞的成骨分化,这种促进作用的实现可能与雌激素微环境下活化人牙周膜干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路有关。

Wnt3a对小鼠beta细胞株增殖的影响

目的分析wnt3a蛋白对小鼠胰腺beta细胞株增殖的影响。方法培养MIN6细胞株,并用不同浓度的wnt3a蛋白或者相同浓度wnt3a蛋白在不同时间点刺激MIN6细胞,用Western blot的方法检测MIN6细胞内的信号分子改变。培养MIN6细胞株,并用wnt3a蛋白刺激,分别在第0、1、2、3、4 d分裂并数细胞个数,比较有wnt3a刺激组与无wnt3a刺激组细胞个数有无区别。结果不同浓度wnt3a刺激,对于MIN6细胞内beta-catenin以及Pitx2的表达有影响,当wnt3a浓度为1:8时,beta-catenin以及Pitx2的表达最高。用1:8的wnt3a蛋白浓度刺激MIN6细胞,分别设置0 min、10 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h。结果显示6 h时,beta-catenin表达量最高。比较控制组与wnt3a刺激组细胞增殖的区别,wnt3a蛋白刺激组细胞增殖程度明显高于控制组。结论wnt3a可以促进胰腺beta细胞的增殖,表明wnt信号通路对于胰腺beta细胞有重要的调控作用。