内异痛经灵调控Wnt7a/β-catenin信号通路改善子宫内膜异位症的实验研究

目的旨在明确内异痛经灵(NYTJL)对大鼠子宫内膜异位症的改善效果并从调控Wnt7a/β-catenin信号通路明确其分子机制。方法将30只雌性,SPF级,SD大鼠,随机分为5组,每组6只。除Control组外,Sham组、Model组、高剂量内异痛经灵(NYTJL-H,40 mg/kg)组和低剂量内异痛经灵(NYTJL-L,20 mg/kg)组均将大鼠子宫内膜固定在腹壁进行上造模;并对应灌胃给药,干预结束后,利用HE染色观察子宫内膜组织形态变化,应用Ki67免疫组化及TUNEL染色检测子宫内膜组织中细胞增殖及凋亡,应用RT-qPCR及蛋白印迹检测子宫内膜组织中Wnt7a及β-catenin的表达,以免疫荧光检测β-catenin的表达。结果与Model组比较,NYTJL高剂量组可以显著改善子宫内膜的组织学形态,降低浸润细胞数量,促进细胞分散排布,减少腺体数量,缩小腺腔体积;与Model组比较,NYTJL-H组和NYTJL-L组均可显著促进异位子宫内膜细胞凋亡,抑制异位子宫内膜细胞增殖;与Control和Sham组比较,Model组Wnt7a和β-catenin的mRNA和蛋白表达均显著上升,而与Model组比较,NYTJL-H组和NYTJL-L组对Wnt7a和β-catenin的表达有显著的抑制作用。结论NYTJL可以抑制Wnt7a/β-catenin信号通路进而促进异位子宫内膜细胞凋亡,进而治疗子宫内膜异位症。

猪miR-192靶向调控Wnt7a基因表达的研究

【目的】鉴定猪miR-192与Wnt家族成员7A(Wnt7a)基因之间的靶向关系,为进一步构建miR-192介导的胚胎通讯提供依据。【方法】使用miRNA pull-down鉴定miR-192和Wnt7a基因间的互作关系;利用生物信息学软件RNAhybrid 2.2预测miR-192和Wnt7a基因3′-UTR的结合位点,构建含有miR-192结合位点的Wnt7a基因3′-UTR野生型和突变型基因片段,克隆至双荧光素酶报告基因质粒,通过NotⅠ、XhoⅠ酶切和测序进行鉴定;鉴定成功的质粒分别与miR-192 mimics和mimics NC共转染猪子宫内膜上皮细胞,检测双荧光素酶活性;将miR-192 mimics、mimics NC、miR-192 inhibitor、inhibitor NC分别与构建的Wnt7a基因3′-UTR野生型和突变型双荧光素酶报告基因质粒共转染至猪子宫内膜上皮细胞,通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测Wnt7a基因mRNA和蛋白的表达水平。【结果】pull-down结果显示,miR-192 mimics组与其阴性对照组相比,Wnt7a基因相对表达量极显著升高(P<0.01),miR-192 input组相对于其阴性对照组极显著降低(P<0.01);RNAhybrid 2.2软件预测到miR-192种子区与Wnt7a基因3′-UTR存在结合位点(UGACCUA);转染Wnt7a野生型质粒的miR-192 mimics和miR-192 mimics NC组相比双荧光素酶活性显著降低(P<0.05),转染Wnt7a突变型质粒的miR-192 mimics和miR-192 mimics NC组之间双荧光素酶活性无显著差异(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,miR-192 mimics组Wnt7a基因mRNA相对表达量显著低于其阴性对照组(P<0.05),miR-192 inhibitor组显著高于其阴性对照组(P<0.05)。Western blotting结果表明,过表达miR-192极显著抑制了Wnt7a蛋白的表达(P<0.01),抑制miR-192后Wnt7a蛋白的表达量极显著上升(P<0.01)。【结论】miR-192能够与Wnt7a基因3′-UTR发生靶向作用并抑制其表达。研究结果可为今后深入研究miR-192在妊娠着床过程中的调控机制提供理论依据。

脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7/β-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究

目的·探讨缺血性脑卒中后脑血管内皮细胞Wnt7/β-catenin信号失活是否导致血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)完整性破坏,并研究内质网应激爆发是否介导了Wnt7/β-catenin通路的抑制。方法·采用线栓法阻断小鼠大脑中动脉建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,脑缺血60 min后拔除线栓。向MCAO模型小鼠腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)作为4-PBA+MCAO组。并设置假手术组(Sham组)。MCAO后24 h用伊文思蓝(Evans blue,EB)测定小鼠BBB的通透性,干湿法测定脑组织含水量,免疫荧光测定小鼠脑血管内皮细胞和周细胞黏附性。对人脑微细血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cells,HBMECs)进行氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation,OGD)4 h,加入4-PBA培养24 h。细胞实验分为空白对照组、OGD组和OGD+4-PBA组。采用CCK-8测定细胞活力,通过检测FITC标记的牛血清白蛋白(FITC-BSA)的通过率来评估细胞通透性;通过ELISA测定HBMECs中血小板衍生生长因子β(platelet-derived growth factorβ,PDGF-β)的分泌水平;采用Fluo-3 AM钙离子荧光探针检测细胞的荧光强度并评估细胞内钙离子浓度,通过CM-H2DCFDA荧光探针测量活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量以明确细胞内质网应激状态;蛋白质印迹法(Western blotting)检测HBMECs中的连接蛋白[紧密连接蛋白1(zonula occludens-1,ZO-1)和密封蛋白5(claudin-5)]、内质网应激蛋白[CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12(cysteine-containing aspartate-specific proteases 12,Caspase-12)]、Wnt7和β-连环蛋白(β-catenin)的表达水平。结果·MCAO模型小鼠脑梗死区水含量较假手术组增加,EB渗出量明显增多(均P<0.05),小鼠脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性下降;腹腔注射4-PBA后MCAO模型小鼠脑水肿程度减轻,BBB的渗透性降低(均P<0.05),脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性增加。与空白对照组HBMECs比较,在OGD条件下细胞活力下降,通透性增加(均P<0.05);同时,OGD组HBMECs中连接蛋白ZO-1、claudin-5的表达水平下降,PDGF-β的分泌水平减少,钙离子浓度升高,ROS含量明显上调,内质网应激蛋白CHOP、GRP78、Caspase-12的表达水平增加,Wnt7和β-catenin的表达水平下降(均P<0.05)。而当HBMECs的OGD模型经4-PBA处理后,OGD导致的HBMECs损伤减轻,细胞中连接蛋白的表达水平增加,HBMECs的通透性降低,PDGF-β的分泌水平增加,并且Wnt7/β-catenin信号的活性明显恢复(均P<0.05)。结论·脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激爆发导致Wnt7/β-catenin信号失活引起的内皮细胞损伤,是BBB破坏的关键途经。

敲低Wnt7a抑制卡介苗诱导的小鼠肺泡上皮细胞自噬

目的探究无翅基因7a(Wnt7a)对牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)感染的肺泡上皮细胞自噬水平的调控作用。方法使用干扰Wnt7a慢病毒及BCG单独作用或共处理TC-1小鼠肺泡上皮细胞,设置小干涉RNA对照(si-NC)组、si-NC联合BCG组、Wnt7a小干涉RNA(si-Wnt7a)组和si-Wnt7a联合BCG组。Western blot法检测Wnt7a、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62及自噬相关基因5(ATG5)蛋白表达水平,利用免疫荧光细胞化学染色检测LC3的分布以确定细胞自噬情况。结果与si-NC组相比,BCG感染的TC-1细胞Wnt7a、LC3和ATG5蛋白表达均升高、LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著增加;与BCG组感染的TC-1细胞相比,si-Wnt7a联合BCG组Wnt7a、LC3、P62及ATG5蛋白表达均显著降低,LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著降低。结论敲低Wnt7a抑制BCG诱导的肺泡上皮细胞自噬。

急性马兜铃酸中毒小鼠肾损伤及Wnt7b/β-catenin/MMP-7的表达变化

目的连续观察急性马兜铃酸Ⅰ(AAⅠ)中毒小鼠肾损伤的病理改变和Wnt通路相关蛋白的表达,探讨Wnt7b信号通路参与马兜铃酸肾病(AAN)损伤修复的机制。方法观察小鼠暴露于AAⅠ后不同时间肾功能的变化,HE和Masson染色观察肾脏病理改变及纤维化情况,免疫组化和电镜观察Wnt7b信号通路相关蛋白的组织和亚细胞的定位和表达。结果小鼠暴露于AAⅠ后血肌酐和尿素氮增多;肾近端小管上皮细胞(PCTEC)刷状缘绒毛脱落、细胞水肿、坏死,小管基底膜裸露、纤维化加重;免疫组化和电镜结果显示,小鼠暴露于AAⅠ后,Wnt7b蛋白在PCTEC的刷状缘聚集,β-catenin的表达从细胞膜下转移至胞质和细胞核内,基质金属蛋白酶-7(MMP-7)表达增多,改变呈时间依赖性(P<0.05)。结论小鼠暴露于AAⅠ后肾脏生理功能异常,PCTEC坏死脱落,在此过程中Wnt7b信号通路被启动,β-catenin和MMP-7蛋白表达量增高。

基于生物信息学分析WNT7B基因在肺腺癌中的表达及其临床意义

目的:基于生物信息学分析WNT7B基因在肺腺癌(LUAD)中的表达及其临床意义。方法:应用生物信息学方法评价WNT7B在LUAD中的诊断和预后预测价值。通过TCGA、GEO数据库研究WNT7B基因在肺癌中表达情况,并分析WNT7B基因在肺癌和非癌组织中表达差异及其表达与生存率、免疫细胞浸润之间的关系。应用STRING数据库筛选共表达基因并构建调控网络,将共表达基因进行基因本体论(GO)以及京东基因和基因组(KEGG)富集分析,同时应用cBioportal探究WNT7B基因突变对肺癌患者生存期的影响。结果:与正常肺组织相比,LUAD组织中WNT7B基因表达水平明显升高(P<0.01),WNT7B基因作为标志物的灵敏度为0.628。K-M生存分析显示,高表达WNT7B组预后较差(P<0.05)。GSEA揭示了5条与WNT7B基因相关的信号通路,WNT7B基因突变的LUAD患者总生存期(P=0.035 8)的预后预测作用不佳。此外,还发现WNT7B基因表达与免疫显著相关。结论:WNT7B基因有望成为LUAD诊断、预后评估和治疗的新靶点,但仍须进一步开展临床相关研究。

Wnt7a-Akt/mTORa信号通路在肾衰营养胶囊改善慢性肾衰竭大鼠骨骼肌萎缩中的作用

目的探讨Wnt7a-Akt/m TOR信号通路在肾衰营养胶囊改善慢性肾衰竭(CRF)大鼠骨骼肌萎缩中的作用及机制。方法采用切除5/6肾的方法制作CRF模型,予4%酪蛋白饲料喂养制作CRF营养不良大鼠模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、中药组和开同组。采用组织病理学检测TA横截面积并计算肌纤维面积分布;采用同位素14+C-苯丙氨酸掺入法检测肌肉蛋白合成;采用Western blot检测Wnt7a-Akt/m TOR信号通路中的蛋白表达。结果肾衰营养胶囊增加了CRF大鼠体质量和骨骼肌质量的作用,形态学表现为TA横截面积增加,促进蛋白质合成增加以及骨骼肌组织Wnt7a-Akt/m TOR信号通路中蛋白表达上调。结论肾衰营养胶囊具有改善CRF模型大鼠骨骼肌萎缩的作用,其机制可能上调骨骼肌Wnt7a-Akt/m TOR信号通路和促进骨骼肌蛋白质合成相关。

莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠Wnt7a和APC表达的影响

目的观察莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠Wnt7a和APC表达的影响。方法用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型(MCAO)。将50只Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组,模型组,莫诺苷小、中、大剂量组(30 mg/kg、90mg/kg、270 mg/kg)。利用蛋白免疫印迹法检测Wnt7a和APC表达变化。结果造模7 d,模型组大鼠皮层Wnt7a的表达比假手术组显著升高,APC表达显著下降;与模型组相比,莫诺苷大剂量组Wnt7a表达明显升高;莫诺苷小、中、大剂量组APC的表达显著降低。结论莫诺苷可以促进缺血性脑损伤后Wnt7a表达,抑制APC表达,从而激活Wnt信号通路。

Wnt7a基因对大鼠骨髓间充质干细胞增殖及向神经元样细胞分化的影响

目的研究Wnt7a基因过表达对大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖和向神经元样细胞分化的影响。方法构建Wnt7a腺病毒,利用病毒感染MSCs,MTT法检测Wnt7a基因腺病毒感染前后MSCs增殖情况,Western blot检测细胞质和细胞核中β-catenin及CyclinD1表达的变化,比较诱导后向神经元样细胞的分化率。结果与对照组细胞相比,Wnt7a腺病毒感染组细胞增殖能力明显增强(P<0.05);细胞质和细胞核中β-catenin蛋白表达量均明显增加(P<0.05);CyclinD1的蛋白表达量也明显增加(P<0.05);诱导后向神经元样细胞分化率明显提高。结论 Wnt7a蛋白表达上调,可能通过提高β-catenin和CyclinD1表达来促进MSCs细胞增殖,Wnt7a蛋白同时促进MSCs向神经元样细胞的诱导分化。

真核表达人Wnt7b基因建立软骨细胞退变模型

目的在真核细胞中表达人Wnt7b基因并且观察对大鼠原代软骨细胞的退变作用。方法取出生24 h SD大鼠关节处软骨,Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞,取P1代细胞进行实验。扩增人Wnt7b基因及克隆至PCDH-GFP上,转染PCDH-GFP和PCDH-Wnt7b至293ft细胞中,48 h后收集细胞上清及转染细胞,Western blot鉴定Wnt7b在293ft细胞中的表达。收集的上清分别稀释10倍和50倍培养大鼠软骨细胞,24 h后观察细胞形态并收集细胞蛋白和抽提RNA,Western blot和定量PCR检测软骨退变指标MMP13、MMP3、Ⅱ型胶原、A-can、ADAMTS5、ColⅩ和SOX9的表达。结果成功克隆人Wnt7b基因至PCDH-GFP载体上且在293ft细胞中得到有效表达。含Wnt7b培养基干预软骨细胞24 h后,软骨细胞形态由原来的多角形变成长梭形,Wnt7b处理组软骨细胞MMP13和MMP3表达显著上调,Ⅱ型胶原的表达下调。PCR结果表明A-can和Sox9表达下降,ColⅩ和ADAMTS5表达增强。结论有效在真核细胞中表达Wnt7b基因并且促进大鼠软骨细胞退变,建立软骨细胞退变的体外模型。

Wnt7b重组反转录病毒载体的构建及其在C3H10T1/2中的表达

背景:诱导骨髓基质干细胞成骨条件的优化与探讨是再生医学研究的热点。前期实验发现Wnt7b在骨发育中的作用,此次实验是前期工作的延续。目的:构建Wnt7b重组反转录病毒载体,观察其在C3H10T1/2中的表达。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-01/2008-08在华盛顿大学医学院和同济大学附属第十人民医院中心实验室完成。材料:pXy-Wnt7b购于ATCC公司,载体pCIG-IRES-EGFP,pLef-Luciferase,pCMV-Rennilla,反转录病毒载体pSFG和包装细胞GP293由华盛顿大学医学院提供。方法:用多步亚克隆技术构建目的基因Wnt7b和标记基因加强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)双表达重组反转录病毒载体pSFG-Wnt7b-IRES-EGFP,在条件培养液中经GP293包装,并在常规培养液中释放出假病毒并将其转染C3H10T1/2细胞,检测成骨活性诱导中的作用和荧光素酶报告基因检测信号转导通路。主要观察指标:①Wnt7b重组反转录病毒转染C3H10T1/2细胞的表达。②Wnt7b诱导C3H10T1/2碱性磷酸酶生成分析。③Wnt7b信号转导分析。结果:构建目的基因的Wnt7b和标记基因EGFP双表达重组反转录病毒载体能够高效地表达,转染C3H10T1/2细胞后能诱导碱性磷酸酶的生成。Wnt7b信号转导分析可见Wnt7b成骨作用通过Noncanonical途径。结论:Wnt7b在C3H10T1/2中能高效表达,能显著诱导骨发育的重要标志--碱性磷酸酶的生成,Noncanonical途径在其中起重要作用。

颞叶癫痫幼鼠海马神经发生与Miat及Wnt7b/β-catenin信号通路的变化

目的:探讨颞叶癫痫幼鼠海马神经发生与Miat及Wnt7b/β-catenin信号通路的变化。方法:将日龄21~23 d的幼鼠分为生理盐水(NS)组与红藻氨酸(KA)组,每组18只。取KA组幼鼠侧脑室注射KA构建颞叶癫痫模型,埋入脑电波接收电极,观察幼鼠的癫痫发作情况与脑电波变化情况。在第1周、第4周、第8周通过Y型迷宫检测幼鼠学习、记忆能力。取幼鼠脑组织,包埋切片后检测BrdU阳性细胞数与DCX蛋白表达。镊取幼鼠海马组织,提取RNA检测Miat含量,提取蛋白检测Wnt7b/β-catenin信号蛋白表达。结果:KA组幼鼠在不同时期出现癫痫发作,脑电波连续出现高频/高幅棘波;随着时间进展,与KA-1周组发作频率[(7.50±1.87)次/天]、发作等级(3.31±0.48)相比,KA-8周组癫痫发作频率[(2.33±1.21)次/天]与等级(1.19±0.40)降低(P<0.05),脑电波中高频/高幅棘波间歇性出现。Y型迷宫中,与NS组相比,KA组幼鼠正确反应次数减少,正确反应时间延长;与KA-1周组正确反应次数[(8.17±1.72)次]、正确反应时间[(11.83±1.72)s]相比,KA-8周组幼鼠正确反应次数[(10.50±2.74)次]增加,正确反应时间[(9.50±2.74)s]缩短。与NS组相比,KA组幼鼠BrdU阳性细胞数、DCX蛋白表达、Miat含量、Wnt7b/β-catenin信号通路与BDNF/TrkB信号通路蛋白表达减少(P<0.05);与KA-1周组相比,KA-8周组幼鼠BrdU阳性细胞数、DCX蛋白表达、Miat含量、Wnt7b/β-catenin信号通路与BDNF/TrkB信号通路蛋白表达增加(P<0.05)。结论:颞叶癫痫幼鼠海马体中存在神经发生减少,这可能与抑制Miat及Wnt7b/β-catenin信号通路相关。

Pax6和Wnt7a在小鼠角膜中的表达分析

目的观察Pax6和Wnt7a在小鼠角膜中的表达及分布情况,探讨Pax6和Wnt7a在角膜中的关系。方法对小鼠与人、家兔、恒河猿的Pax6和Wnt7a氨基酸序列同源性进行生物信息学分析;石蜡切片法观察小鼠眼球壁的形态结构;免疫组织化学技术和流式细胞术分别检测Pax6和Wnt7a在小鼠角膜中的分布和表达。结果小鼠和人、家兔、恒河猿的Pax6和Wnt7a蛋白氨基酸序列同源性都超过90%,其中小鼠和人的同源性最高。HE染色显示了正常小鼠的眼球壁结构。Pax6的免疫阳性表达在小鼠角膜全层的细胞质和细胞膜上,阳性表达率约为77.84%;Wnt7a的免疫阳性主要表达在小鼠角膜全层的细胞膜上,阳性表达率约为63.51%。结论Pax6和Wnt7a均在小鼠角膜中高表达,可能参与角膜的形成。

LINGO-1介导Wnt7b促进脊髓神经干细胞增殖的作用

目的观察LINGO-1与Wnt7b在脊髓神经干细胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)增殖过程中的表达及作用。方法体外培养C57BL/6小鼠NSPCs并分为对照组及干扰组,scramble组感染scramble慢病毒,干扰组感染LINGO-1 shRNA慢病毒下调LINGO-1表达,并验证其下调LINGO-1基因的效率,观察NSPCs的增殖情况。通过转录组测序,筛选LINGO-1下游作用mRNA。体外观察下调LINGO-1表达,Wnt7b的mRNA及蛋白表达情况。结果小鼠脊髓来源NSPCs表达神经干细胞特异性标志物Nestin。慢病毒转染NSPCs后,转染效率达到90%以上,LINGO-1 shRNA可以使LINGO-1表达下降至对照组的0. 42±0. 067倍(P <0. 05)。干扰组S期较对照组S期显著增高(23. 6%±2. 1%vs 13. 1%±1. 7%,P <0. 05)。转录组测序提示LINGO-1功能主要富集于蛋白结合功能调控,其中Wnt7b为可能调控因子。与对照组相比较,LINGO-1 shRNA组mRNA提高3. 4±0. 22倍(P <0. 05),蛋白表达提高2. 0±0. 14倍(P <0. 05)。结论 LINGO-1可以在体外下调脊髓神经干细胞增殖,这一作用可能与其下调Wnt7b表达有关。

高侵袭性膀胱癌细胞中的Wnt7a和MMP-10表达及相关性分析

目的探讨Wnt7a和MMP-10在高侵袭性膀胱癌细胞中的表达作用及两者之间的相关性。方法通过qRT-PCR和Western blot检测高侵袭膀胱癌细胞(5637 HUBC)和对照低侵袭性膀胱癌细胞(5637 NUBC)中Wnt7a和MMP-10的表达情况,通过Wnt7a siRNA转染HUBC细胞,检测转染后Wnt7a和MMP-10的表达情况,通过Millicell小室检测转染后5637 HUBC细胞的侵袭能力,收集膀胱癌(BC)组织标本和癌旁组织,通过qRT-PCR和Western blot检测两者表达情况,Pearson相关分析两者相关性。结果与对照5637 NUBC相比,5637 HUBC细胞中Wnt7a和MMP-10的mRNA表达水平增加,并且Wnt7a和MMP-10的蛋白质表达水平也增加(P均<0.01);转染两种不同的siRNA(siWnt7a-1和siWnt7a-2)和对照siRNA(siCTL)后,Wnt7a的mRNA表达降低,Wnt7a和MMP-10蛋白水平在功能丧失实验后均降低,经过Transwell实验发现,与对照组比较,敲除Wnt7a后,5637 HUBC的侵袭能力减低;BC组织和正常癌旁组织Wnt7a和MMP-10的表达差异明显(P<0.01),Wnt7a和MMP-10表达呈正相关(r=0.584,P=0.002)。结论Wnt7a及其下游基因MMP-10在BC细胞侵袭性方面发挥重要作用,Wnt7a及其相关的MMP-10基因位点有希望成为BC细胞侵袭和转移的药物靶点。

肾衰营养胶囊改善CRF大鼠骨骼肌萎缩中Wnt7a/PCP信号通路的作用探析

目的分析肾衰营养胶囊改善CRF大鼠骨骼肌萎缩中Wnt7a/PCP信号通路的作用。方法选取2018年1月~6月饲养大鼠80只为研究对象,随机摸球法分为正常组、模型组、开同组和中药组。检测Myogenin以及MyoD表达,以及Wnt7a/PCP信号通路内蛋白表达。结果相比于正常组,模型组大鼠湿重、和干重均更低;开同组和中药组治疗后干重、湿重均有显著提升;模型组细胞内Myogenin阳性细胞核数多于正常组;中药组和开同组Myogenin阳性细胞核显著多于模型组,中药组和开同组MyoD光密度值低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论肾衰营养胶囊可有效改善CRF大鼠骨骼肌萎缩中Wnt7a/PCP信号通路。

小鼠脊髓发育候选基因Wnt7b的初步研究

目的:探讨Wnt7b基因及Wnt信号系统分子对小鼠脊髓发育的作用。方法:基因测序比较A/J和C57BL/6J两种小鼠Wnt7b基因开放阅读框架序列差异;以RT-PCR方法测定Wnt7b基因在两种小鼠组织中的表达差异;免疫组化法测定Frizzled在2种孕14天胎鼠脊髓上的表达和分布。结果:测序结果中发现两种小鼠Wnt7b开放阅读框架序列结构具有差异;在2种小鼠8种组织中,脊髓、肌肉、脾和肾中的Wnt7b基因表达具有明显差异;免疫组化的测定表明,发育14天的胎鼠脊髓上的Frizzled表达强度和分布范围具有显著差异,尤其是A/J小鼠在神经管周围表达明显强于C57BL/6J。结论:基因表达差异和基因结构差异提示,Wnt7b基因与脊髓发育具有一定的关联,应为一脊髓发育候选基因;Frizzled的强表达与脊髓发育的抑制相关,Wnt7b的信号转导途径介导了控制脊髓发育的过程。

Wnt7a抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移

目的探讨Wnt7a在胃癌发生发展中的作用及机制,为胃癌的临床治疗提供潜在靶点。方法实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)及Western blot技术检测胃癌组织中Wnt7a mRNA及蛋白水平的表达变化,通过免疫组织化学法检测癌胃癌组织中Wnt7a的表达和分布情况,以癌旁正常组织作为对照;观察Wnt7a的差异表达与胃癌临床病理参数及预后的关系;Wnt7a过表达质粒转染胃癌细胞系SGC7901,通过MTS实验和EDU实验检测细胞的活性和增殖状态,流式细胞仪检测细胞的凋亡状态,Transwell实验检测细胞的侵袭和迁移状态。结果 qRT-PCR及Western blot结果显示,与癌旁正常组织相比,Wnt7a在m RNA及蛋白水平表达下调,免疫组织化学结果显示Wnt7a阳性表达呈棕黄色颗粒状,主要分布于细胞胞质,在胃癌组织的阳性率明显低于正常胃组织;与高表达Wnt7a患者相比,Wnt7a低表达患者胃癌的肿瘤体积相对较大,TNM分期较高,淋巴结转移率较高,预后较差;在SGC7901细胞中过表达Wnt7a能够显著抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移,对细胞的凋亡能力无明显影响。结论在胃癌的发生发展中,Wnt7a发挥了抑癌基因的作用,抑制细胞增殖、侵袭和迁移。

Wnt7b/β-catenin信号通路分子在肺泡Ⅱ型上皮细胞转分化过程中的变化

目的探讨Wnt7b/β联蛋白(β-catenin)信号通路分子在胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(f AEC2)分化过程中的变化。方法取孕19 d胎鼠肺组织,分离、纯化得到fAEC2。培养细胞48、72、96 h,倒置显微镜观察fAEC2形态变化,免疫荧光染色观察β-联蛋白(β-catenin)的表达,实时定量PCR检测细胞中Wnt7b、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、表面蛋白C(SP-C)和水通道蛋白5(AQP5)的mRNA变化,Western blot法检测cyclin D1、细胞核β-catenin、SP-C、AQP5蛋白的表达。结果 fAEC2培养48 h,β-catenin在细胞膜表达;培养72 h,β-catenin在细胞膜的表达较前减弱,在细胞质、细胞核中表达增强;培养96 h,全细胞β-catenin表达下调。Wnt7b、cyclin D1 mRNA的表达在72 h时显著增高,96 h时下降明显;SP-C mRNA的水平随培养时间的延长逐渐下降,AQP5 mRNA的水平逐渐升高。Cyclin D1、细胞核β-catenin蛋白在72 h时表达上调,96 h时表达下调;SP-C蛋白的表达量逐渐降低;AQP5蛋白的水平逐渐升高。结论 Wnt7b/β-catenin信号通路可能在fAEC2转分化中起重要作用。

WNT7b促进黑素瘤细胞的迁移、侵袭与上皮间质转化

目的:明确WNT7b在恶性黑素瘤发生、发展中的作用,探索其促进恶性黑素瘤细胞发生侵袭转移的机制。方法:通过qRT-PCR及Western blot检测人源黑素瘤细胞系中WNT7b的表达情况,挑选WNT7b高表达细胞系A375,瞬时转染小干扰RNA敲低WNT7b的表达。采用流式细胞仪分析细胞周期,划痕实验、Transwell实验观察敲低WNT7b对A375细胞系增殖、迁移和侵袭功能的影响。通过Western blot检测上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)关键标志物及与黑素瘤发生发展密切相关的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)家族成员的表达。结果:WNT7b在人恶性黑素瘤细胞系A375、SK-MEL-28、A875中均有表达,A375的WNT76较其他细胞系表达量更高;敲低WNT7b使A375细胞生长阻滞于G1期,同时细胞迁移与侵袭能力受到抑制。检测EMT相关蛋白,发现E-cadherin表达上调,N-cadherin和Vimentin表达下调。进一步检测MMP家族成员的表达,发现MMP-2、MMP-7与MMP-9降低。结论:WNT7b在人源黑素瘤细胞中可能通过抑制MMP的表达,诱导EMT的发生,从而促进黑素瘤细胞的迁移与侵袭。