哈茨木霉酸性蛋白酶基因的克隆表达及其水解应用

为了对哈茨木霉酸性蛋白酶(Acid Protease,Ap)的性质研究,采用RT-PCR克隆了哈茨木霉Ap基因,转化至毕赤酵母GS115菌株中获得高效表达,然后对该重组蛋白酶(Recombinant Acid Protease,rAp)的酶学性质和水解大豆分离蛋白的效果进行测定。结果表明,重组毕赤酵母在500 mL三角瓶中诱导表达时,发酵液中rAp酶活力达到21.50 U/mL。该rAp为天冬氨酸蛋白酶,最适温度为55℃,在40℃处理120 min仍具有较强的热稳定性;最适pH值为2.50,在不同pH缓冲液中处理24 h后,pH值2.00~5.00具有较强稳定性。Cu^(2+)、Ni^(2+)和Mn^(2+)能显著促进活性,相对酶活分别高达116.21%、113.79%和117.44%;而Fe^(2+)、Fe^(3+)、0.50%SDS和5.00%Trion X-100显著抑制活性,其相对酶活分别78.02%、79.26%、2.6%和13.19%。rAp和胃蛋白酶对大豆分离蛋白水解后,水解产物中蛋白相对含量分别为14.67%和3.64%,β-伴大豆球蛋白抗原性分别降低了30.01%和26.10%,球蛋白抗原性分别降低了22.37%和15.63%。从以上结果可知,rAp对大豆分离蛋白具有较强水解和降低抗原性的能力,具有潜在的应用开发价值。

产蛋白酶芽孢杆菌的筛选、耐酸性驯化及蛋白酶酶学性质分析

该研究利用透明圈法及蛋白酶活力测定从高温大曲中筛选高产蛋白酶的菌株,通过形态学观察和分子生物学技术对其进行菌种鉴定。进一步对筛选菌株的耐酸性进行驯化,并对其耐受性及所产蛋白酶酶学性质进行研究。结果表明,分离筛选到一株高产蛋白酶活力的菌株Cy3,经鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),其在最适生长pH 6条件下所产蛋白酶活性为505.0 U/m L。通过对菌株Cy3进行耐酸性驯化后,得到菌株Cy3-驯,成功将其生长p H驯化至5,培养15 h时OD600 nm值提高2.54倍。菌株Cy3-驯所产蛋白酶的最适反应温度从60℃提高至70℃,最适反应p H值为6,但活性及稳定性略有下降。菌株Cy3-驯具有较好的NaCl和葡萄糖耐受性,最高耐受含量分别为15%和60%,同时在乙醇体积分数8%以及乳酸体积分数3%时仍能生长。

日粮中添加不同水平酸性蛋白酶对白羽肉鸡生产性能、血清生化指标和肠道形态的影响

本试验旨在研究添加不同水平酸性蛋白酶对白羽肉鸡生产性能、血清生化指标和肠道形态的影响。选取1日龄罗斯308白羽肉鸡400只,随机分为4组(每组10个重复,每重复10只鸡):其对照组饲喂基础日粮,试验组饲喂分别添加0.40、0.80、1.60 U/g酸性蛋白酶的试验日粮,试验全期42d,分为前后两个试验阶段。结果表明:(1)生长性能:1-21日龄阶段,日粮中添加酸性蛋白酶可显著提高白羽肉鸡21日龄末重、ADG和降低F/G(P<0.05)。22-42日龄阶段,酸性蛋白酶对白羽肉鸡42日龄末重、ADG、ADFI和F/G无显著影响(P>0.05)。(2)血清生化指标:添加0.8 U/g酸性蛋白酶可显著提高白羽肉鸡21日龄的血清IgG、IgM含量(P<0.05);添加0.40 U/g可显著提高白羽肉鸡42日龄血清IgA含量(P<0.05)。添加酸性蛋白酶对白羽肉鸡21、42日龄的血清TP、ALB、GLB和BUN含量均无显著影响(P>0.05)。(3)肠道形态:1-21日龄,添加0.4 U/g酸性蛋白酶可显著提高回肠V/C(P<0.05);添加0.8 U/g可显著提高空肠、回肠绒毛高度和回肠V/C(P<0.05);添加1.6 U/g时可显著提高回肠绒毛高度(P<0.05),空肠隐窝深度和空肠V/C各组间差异不显著(P>0.05)。22-42日龄,各组间空肠和回肠绒毛高度、隐窝深度和V/C差异不显著(P>0.05)。由此可见,1-21日龄日粮中添加酸性蛋白酶可改善白羽肉鸡生产性能、提高其免疫能力和促进肠道形态。综合各项指标及添加成本,在白羽肉鸡1—21日龄日粮中添加0.4 U/g酸性蛋白酶,可获得较好生产性能与经济效益。

不同蛋白质水平饲粮中添加酸性蛋白酶对肉鸡生长性能和养分表观消化率的影响

本试验旨在研究不同饲粮蛋白质水平和不同酸性蛋白酶添加剂量对肉鸡生长性能和养分表观消化率的影响,为酸性蛋白酶在肉鸡饲粮中的合理使用提供参考。采用4×2析因设计,2个因素分别为酸性蛋白酶添加剂量和饲粮蛋白质水平,4个酸性蛋白酶添加剂量分别为0、125、250和500 g/t酸性蛋白酶;2种蛋白质水平分别为正常蛋白质水平(基础饲粮)和低蛋白质水平(低蛋白质饲粮,在基础饲粮蛋白质水平基础上降低约1%)。试验选取体况良好的7日龄白羽肉鸡1440只,随机分为8个组,每个组6个重复,每个重复30只鸡。各组分别饲喂基础饲粮(Ⅰ组)、基础饲粮+125 g/t酸性蛋白酶(Ⅱ组)、基础饲粮+250 g/t酸性蛋白酶(Ⅲ组)、基础饲粮+500 g/t酸性蛋白酶(Ⅳ组)、低蛋白质饲粮(Ⅴ组)、低蛋白质饲粮+125 g/t酸性蛋白酶(Ⅵ组)、低蛋白质饲粮+250 g/t酸性蛋白酶(Ⅶ组)和低蛋白质饲粮+500 g/t酸性蛋白酶(Ⅷ组),其中饲喂基础饲粮的Ⅰ组和低蛋白质饲粮的Ⅴ组为对照组。试验期为42 d。结果显示:1)在基础饲粮条件下,与对照组(Ⅰ组)相比,Ⅱ组肉鸡前期平均日增重显著提高(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ组肉鸡后期平均日采食量和平均日增重显著提高(P<0.05),Ⅱ、Ⅳ组肉鸡全期平均日增重显著提高(P<0.05);在低蛋白质饲粮条件下,与对照组(Ⅴ组)相比,Ⅶ组肉鸡前期平均日增重显著提高(P<0.05),Ⅶ、Ⅷ组肉鸡全期平均日增重显著提高(P<0.05)。2)在基础饲粮条件下,与对照组(Ⅰ组)相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肉鸡对干物质的表观消化率显著提高(P<0.05);Ⅲ、Ⅳ组肉鸡对粗蛋白质、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸的表观消化率显著提高(P<0.05);在低蛋白质饲粮条件下,与对照组(Ⅴ组)相比,Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组肉鸡对干物质、半胱氨酸、缬氨酸和酪氨酸的表观消化率显著提高(P<0.05);Ⅶ、Ⅷ组肉鸡对粗蛋白质、丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的表观消化率显著提高(P<0.05);Ⅷ组肉鸡对天门冬氨酸、苏氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸和脯氨酸的表观消化率显著提高(P<0.05)。3)基础饲粮条件下,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组每只鸡毛利润比Ⅰ组分别提高0.64、0.44、0.62元;低蛋白质饲粮条件下,Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组每只鸡毛利润比Ⅴ组分别提高0.32、0.63、0.57元。综上所述,在不同蛋白质水平饲粮中添加酸性蛋白酶均能提高肉鸡的生长性能和养分表观消化率,并降低死淘率。在基础饲粮中,试验前期和后期推荐肉鸡饲粮中分别添加125和500 g/t酸性蛋白酶;在低蛋白质饲粮中,试验前期和后期推荐肉鸡饲粮中分别添加250和500 g/t酸性蛋白酶。

三种酸性蛋白酶等电点测试方法的比较

采用Zeta电位法、沉淀法和等电聚焦电泳(IEF)法测定了不同来源的四种酸性蛋白酶的等电点(pI),并比较了这三种方法用于测量酸性蛋白酶pI的优缺点。结果表明:Zeta电位法适用于检测各种酸性蛋白酶,但需要指出的是,对于工业级酶制剂,该方法获得的pI值是其各组分pI值的综合结果;沉淀法难以观察到高溶解度蛋白酶的pI沉淀现象,但使用粒径分析仪检测酶溶液的粒径变化情况可以获得准确的pI;IEF法能准确分析pI大于3的酸性蛋白酶,但有些酸性蛋白酶制剂的酶蛋白组分的pI小于3,因此该方法不适用于检测所有的酸性蛋白酶。

酸性蛋白酶AP-10分离纯化及其酶学性质

采用活性炭吸附脱色、硫酸铵分级沉淀、脱盐和凝胶层析等技术对酸性蛋白酶AP-10浓缩液进行了分离纯化,并对其酶学性质进行了研究。结果表明,分离纯化后得到的酸性蛋白酶AP-10纯组分比酶活为5800 U·mg^(-1),纯化倍数为6倍;最适反应温度为40℃,热稳定范围为30~45℃;最适反应pH值为3.0,pH值稳定范围为3.5~6.5;Mn^(2+)对酸性蛋白酶AP-10具有强烈的激活作用,Fe 2+对酸性蛋白酶AP-10具有强烈的抑制作用。为拓展酸性蛋白酶AP-10的应用及开发高品质产品奠定了基础。

高产酸性蛋白酶白曲霉培养条件的优化研究

以实验室保藏的白曲霉菌株为目标菌株,从生长条件、产酶活力的关键工艺因素进行研究分析,以提高白曲霉菌株酸性蛋白酶活力为目的,探究高产酸性蛋白酶白曲霉的实验室最佳培养条件。研究结果表明,以麸皮为主要原料,培养基水分添加量为100%,培养基pH值为5,培养温度38℃,培养时间72 h,为该实验菌株的实验室最佳培养条件。

黑曲霉固态发酵餐厨垃圾生产酸性蛋白酶

餐厨垃圾作为餐饮行业中的大宗废弃物,目前主要是进行填埋处理,既浪费了资源又不利于环保。采用黑曲霉固态发酵餐厨垃圾生产酸性蛋白酶,为这一资源的综合利用开辟了新途径。通过单因素试验考察了黑曲霉接种量、培养基含水量及发酵时间3个重要因素对固态发酵餐厨垃圾生产酸性蛋白酶的影响。在单因素试验基础上,采用正交试验优化产酶工艺参数。结果表明,30 g餐厨垃圾固态发酵培养基中,黑曲霉接种量4 mL,加水量22 mL,30℃发酵70 h,此工艺条件下所得酸性蛋白酶的活力最高。

微波诱变结合化学诱变选育酸性蛋白酶高产菌

酸性蛋白酶是酶制剂工业比较重要的酶种，广泛应用于饲料、食品、皮革、医药和酿造工业中［１～４］，具有较大的市场潜力。本研究以宇佐美曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｕｓｕｓａｍｉ）白色突变株Ｂ１为出发菌株，通过微波诱变和亚硝基胍、硫酸锂复合诱变剂点试平板法诱变，选...

复合诱变选育酸性蛋白酶高产菌株

以米曲霉M-2为出发菌株,通过紫外线-氯化锂和硫酸二乙脂(DES)复合诱变,筛选酸性蛋白酶高产突变株,并进行固态发酵筛选试验。从大量突变株中进行筛选,获得1株遗传性稳定的酸性蛋白酶高产突变株D-7,其酶活力由出发菌的262.7U/g提高至602.5U/g,提高了129.3%。

中性和酸性蛋白酶对断奶仔猪生长性能的影响

选用135头平均体重为(7.2±0.1)kg的杜×长×大三元杂交断奶仔猪,采用3×3两因子完全交叉试验设计,研究了日粮中添加3个中性蛋白酶水平(0、0.004%和0.008%)和3个酸性蛋白酶水平(0、0.004%和0.008%)对断奶仔猪生长性能的影响。试验共设9组,每组3个重复,每个重复5头猪。试验期为28 d,分为前期(1～14 d)和后期(15～28 d)2个阶段。结果表明,中性和酸性蛋白酶对断奶仔猪的前期、后期和全期的平均日增重和料重比有显著影响(P<0.05);对腹泻率无显著影响(P>0.05)。其中添加0.008%的中性蛋白酶和0.004%的酸性蛋白酶可显著提高断奶仔猪的平均日增重和平均日采食量,显著降低料重比(P<0.05),而单独在日粮中添加0.008%酸性蛋白酶时料重比最高(P<0.05)。由此可知,中性和酸性蛋白酶可一定程度上提高断奶仔猪生长性能,以添加0.008%的中性蛋白酶和0.004%的酸性蛋白酶效果最好,且两者存在互作效应。

黑曲霉菌株6042饲用酸性蛋白酶的性质及其应用研究

对黑曲霉变异菌株６０４２产生的酸性蛋白酶的性质及其作饲料添加剂的应用研究表明：酶作用条件基本与动物消化道生理条件相适应，最适ｐＨ为３．０～３．５，最适温度为４０～５０℃。酶液在４０℃以下稳定，５０℃以上则不稳定，６０℃处理３０分钟基本失活。固体粗酶制品的稳定性较好，室温保存半年酶活仅损失１３．４％。在最佳作用条件下，对酵母和鱼粉具有明显的降解作用，氨基酸总量分别比对照增加８９．７％和６１．８％。将５０００ｕ／ｇ的饲用酸性蛋白酶制剂以０．１％添加于乳猪及仔猪饲料中，日增重和饲料转化率分别比对照提高７．７７％和４．７１％。

白念珠菌的毒力研究—分泌性酸性蛋白酶活力的测定

目的 研究白念珠菌的毒力与分泌性酸性蛋白酶活力间的关系。方法 将分离自血液、鹅口疮、念珠菌性阴道炎及健康带菌者的白念珠菌接种于牛血清白蛋白培养基 (BSA)上 ,经氨基黑染色后 ,测量蛋白分解区。结果 来源于患者的白念珠菌分泌性酸性蛋白酶活力明显高于健康带菌者。结论 白念珠菌的毒力与其分泌性酸性蛋白酶活力呈正相关 。

Cd Pb污染土壤中蛋白酶酸性磷酸酶脱氢酶活性的变化

通过现场采样及室内分析方法,研究了Cd、Pb严重污染的土壤中蛋白酶、酸性磷酸酶和脱氢酶活性的变化及其与土壤Cd、Cu、Pb、Zn含量和土壤基本性质之间的关系。通径分析表明,影响蛋白酶活性主要直接因素为土壤有效Cd、土壤有效Zn、砂粒和黏粒,其中土壤有效Zn刺激了酶活性而土壤有效Cd抑制了酶活性;影响酸性磷酸酶活性主要直接因素为碱解氮、速效磷、pH值,土壤有效Cu、土壤有效Cd、土壤有效Pb、土壤有效Zn对酸性磷酸酶的直接影响较小;影响脱氢酶活性主要直接因素为土壤有效Cd、土壤有效Zn、土壤速效钾,其中土壤有效Cd抑制了酶活性而土壤有效Zn刺激了酶活性。总体而言,4种重金属有效态对酶活性毒性大小依次为:Cd>Cu>Pb>Zn。综合简单相关分析结果可知,总体上Cu、Cd、Pb、Zn复合污染刺激了蛋白酶活性,抑制了脱氢酶活性,对酸性磷酸酶活性影响不大,脱氢酶可作为上述土壤重金属复合污染的指标。3种土壤酶活性变化是重金属与土壤理化性质综合作用的结果。

黑曲霉酸性蛋白酶在食醋酿造中的催化效应

从麸醋母曲中分离出黑曲霉Asp 5 6 0 9并以此为诱变出发菌株 ,采用紫外线照射结合亚硝基胍诱变剂处理 ,筛选出酸性蛋白酶高产变异株Asp 5 6 0 9 7。用盐溶加温提取法从Asp 5 6 0 9 7固体发酵物料中提取酸性蛋白酶粗酶液 ,经DC 30型中空纤维柱超滤浓缩 ,用于食醋酿造物料蛋白的酶解催化 ,可大幅度提高醋液中氨基酸含量。

酒精发酵中应用酸性蛋白酶的研究

对酸性蛋白酶在酒精发酵中的应用进行了研究。添加酸性蛋白酶有利于原料中蛋白质的水解，增加醪液中酵母可吸收性氮，促进酵母菌生长繁殖，提高酒精发酵速率。而且，a-氨基氮的增加，减轻了酵母菌细胞氨基酸合成代谢的负荷，使底物（葡萄糖）更多地转向发酵生成乙醇，提高原料出酒率。接种酵母后，在醪液中添加0．01％的酸性蛋白酶，发酵时间由原来的52h缩短到32h，发酵成熟醪酒精含量为10．2％（V）。着延长发酵时间至44h，则发酵成熟醪中酒精含量由原来的9．8％（V）增加到10．7％（V），并对添加酸性蛋白酶和（NH4）2SO4的发酵结果进行了比较，认为酸性蛋白酶是实现高效率酒精发酵的优选促进剂。

米曲霉高产酸性蛋白酶菌株的选育

用2%的纤维素酶,35℃下水浴酶解3 h制得米曲霉部分去壁孢子,以它为诱变对象对其进行Licl-微波,DES-超声波复合诱变,并利用酪蛋白平板初筛,三角瓶固体培养测酶活复筛。最终选出1株高产酸性蛋白酶的菌株C2,其产酸性蛋白酶活力是原始菌株的135.0%。

酸性蛋白酶高产菌株6042（Aspergillus niger 6042）的选育和形态鉴定

由黑曲霉ＣＰｕ菌株用６０Ｃｏγ射线诱变处理，经初筛、复筛，获得５株酸性蛋白酶变异菌株。其中６０４２菌株的形态变异株酸性蛋白活力比出发菌株提高近４倍，经多次传代酶活力稳定。用福林法测定，酸性蛋白酶活力高达２．３万ｕ／ｇ曲。经形态鉴定菌落大小和孢子颜色与原始菌株有明显差异。

高产酸性蛋白酶黑曲霉菌种选育

从麸醋醋母中分离出黑曲霉Asp5609,用15W紫外灯照射8min,照射距离30cm,在暗处30℃培养3d后挑取透明圈大的菌落用亚硝基胍诱变处理,筛选出高产酸性蛋白酶变异株Asp5609 7.在培养基pH5.0,含水量50%,培养时间60h,变温培养等优化条件下获得固体发酵达35000U/g.干基的酸性蛋白酶物料.

大曲中高产酸性蛋白酶霉菌的分离鉴定

蛋白酶可将蛋白质分解成游离氨基酸,这不仅能促进微生物的生长,而且有助于风味物质前体物质的生成。本文从高温大曲中分离纯化得到了6株产蛋白酶的霉菌。通过酪蛋白透明圈法、双指示剂甲醛滴定法和福林-酚法的酶活力测定,鉴定出一株能高产酸性蛋白酶的青霉D,其酶活力为9.435U/mL,以及一株能高产中性蛋白酶的曲霉C,其酶活力为11.000U/mL。结合形态标记和18SrDNA系统发育对其进行分类鉴定,结果是:青霉D为意大利青霉(Penicillium polonicum),曲霉C为米曲霉(Aspergillus oryzae)。