不同酸碱性稀释液联合一水肌酸对猪X、Y精子分离效果的研究

旨在探究调整猪精液稀释液酸碱性联合一水肌酸(ceatine monohydrate,CMH)对猪X、Y精子的分离效果。本研究使用8头2~4岁健康的杜洛克公猪采集精液,通过调整精液稀释液Beltsville(BTS)的pH,使用精子计算机辅助分析系统(CASA)检测精子活率和运动轨迹确定X、Y精子分选体系最适pH,利用CASA检测精子运动性能确定一水肌酸最适添加浓度。通过免疫荧光染色和流式细胞术评估X、Y精子分选效果,利用荧光标记法、精子活性氧MitoSOX Red染色等方法检测精子顶体、质膜完整性、活性氧含量等精子质量指标。结果表明,当稀释液pH为6.4和7.1时,孵育60 min对精子活率无显著影响(P>0.05),上层精子前向性运动占比极显著高于下层(P<0.01)。稀释液中添加750μmol·L^(-1)一水肌酸孵育60 min时显著提高了精子活力、直线运动速率、曲线运动速率和摆动性(P<0.05)。使用酸性稀释液联合一水肌酸分选猪X、Y精子,分选后上层精液X精子占比达63.32%;碱性稀释液联合一水肌酸分选猪X、Y精子,分选后上层精液Y精子占比达到67.19%。进一步研究发现,分选后顶体完整性、质膜完整性和ROS水平同对照组相比无显著差异(P>0.05),ATP水平、线粒体膜电位和运动性能显著高于对照组(P<0.05)。综上,本研究通过调整稀释液酸碱性并联合一水肌酸建立了一种简便、价廉和快捷的猪X、Y精子分选体系,该方法不影响分选后精子质量并提高精子运动性能,进一步为猪性控精液新技术研发提供试验依据。

癌-睾丸抗原SPANXB在肝癌中的表达及其影响肝癌进展的机制研究

目的·分析癌-睾丸抗原(cancer-testis antigen,CTA)家族成员SPANXB(sperm protein associated with the nucleus on the X chromosome B)在肝癌中的表达及其与肝癌患者预后之间的相关性,并探究SPANXB对肝癌细胞增殖的影响及其潜在机制。方法·利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中的肝癌样本数据,分析SPANXB在肝癌组织中的表达及其与患者生存期的相关性。构建稳定敲低SPANXB与稳定过表达SPANXB的肝癌细胞系,利用活细胞成像实验、EdU细胞增殖实验和平板克隆形成实验评估SPANXB对肝癌细胞增殖的影响。通过RNA测序(RNA-sequence,RNA-seq)探究SPANXB调控肝癌细胞增殖的相关通路,并利用细胞周期实验验证SPANXB对肝癌细胞周期的影响。采用免疫沉淀-质谱联用技术(immunoprecipitation-mass spectrometry,IP-MS)探索与SPANXB相互作用的蛋白,并使用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)进行验证。结果·SPANXB mRNA在肝癌组织中的表达高于正常组织(P=0.003),且与肝癌患者的生存期呈负相关。稳定敲低SPANXB可降低肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力,而稳定过表达SPANXB则可促进这些过程。RNA-seq的结果显示,SPANXB的敲低可下调DNA复制与G1/S细胞周期转换相关通路,细胞周期实验的结果显示SPANXB的敲低可导致肝癌细胞周期发生改变。IP-MS和Co-IP结果显示,SPAXNB与有丝分裂停滞缺陷2样蛋白1(mitotic arrest deficient 2-like protein 1,MAD2L1)、WD重复域蛋白5(WD repeat domain 5,WDR5)等细胞周期相关蛋白存在相互作用。结论·SPANXB的高表达与肝癌的预后呈负相关,其可能通过与MAD2L1、WDR5相互作用调控细胞周期并增强肝癌细胞的增殖活性。

45,X/46,XY混合性性腺发育不全患者采用卵母细胞捐赠获得活产1例及文献复习

目的:探讨45,X/46,XY混合性性腺发育不全的病因、诊断、治疗、受孕及分娩的临床特点,提高对此类患者的诊治及妊娠管理水平。方法:回顾性分析1例45,X/46,XY混合性性腺发育不全妊娠患者的临床资料并结合相关文献进行讨论。结果:通过患者第二性征发育不全、条索状性腺、染色体核型与社会性别不符等临床特征,结合性腺组织染色体畸变检测结果,确诊患者为45,X/46,XY混合性性腺发育不全,并给予“卵母细胞捐赠ICSI-ET治疗”获得活产。结合文献分析总结此类患者妊娠受孕、妊娠及分娩过程中的临床特点。结论:45,X/46,XY混合性性腺发育不全女性患者无生育能力,可通过卵母细胞捐赠获得妊娠,但此类孕妇的妊娠并发症的发病率以及异常分娩率均高于普通人群。明确诊断,加强妊娠风险评估,以改善围产结局。

奶牛X性控冻精应用研究

利用SX—MOFLO精子分离设备分离奶牛XY精子，将分离后的奶牛X精子冷冻保存。探讨奶牛X性控冻精解冻后存活时间、不同方法进行人工授精的受胎率，为奶牛X性控冻精的大规模推广应用提供依据。方法与结果：（1）取不同种公牛、不同批次的X性控冻精及普通冻精解冻后倒人5ml。试管内摇匀，至37℃水浴锅中，每2h检测一次精子活力，4h后每小时检测一次精子活力，直至无运动精子。结果奶牛X性控冻精存活时间为5～12h，比同种普通精于的存活时间短2～10h。（2）应用奶牛X性控冻精人工授精的母牛的情期受胎率（59．4％=342／576）与普通冻精的情期受胎率（60．6％=129／213）相比，无显著差异（P〉0．05）。奶牛X性控冻精母犊出生准确率93．3％（319／342），极显著地高于普通冻精48．8％（63／129）的母犊率（P〈0．001）。且应用奶牛X性控冻精人工授精后的青年牛的情期受胎率（65．6％=240／366）极显著的高于经产牛的情期受胎率（48．6％=102／210）（P〈0．001）。（3）在母牛发情结束后6～8h左右进行人工授精，其情期受胎率为67．1％（116／173），显著地高于在母牛发情开始后8～12h进行人工授精56．1％（226／403）的情期受胎率（P〈0．01）。（4）在准确判断母牛卵巢上卵泡发育状态的前提下，将精液全部输至发育侧子宫角大弯处，其情期受胎率62．7％（289／461），高于母牛每侧子宫角输1／2支X性控冻精46．1％（53／115）的情期受胎率，但二者之间差异不显著（P〈0．05）。研究结果表明应用奶牛X性控冻精进行人工授精，其受胎率与奶牛的经产与否、授精时间和输精部位有关。

维生素C对荷斯坦公牛X精子冻后品质的影响

试验旨在研究维生素C(VC)对荷斯坦公牛性控精液冻后品质的的影响。在精液稀释液中分别添加0,2.0,4.0,6.0,8.0 mg/mL的VC进行试验。将装有X精子的细管冻精解冻(37.5℃,30 s)后分析0～3 h精子活率及0～4 h质膜完整率和顶体完整率的变化情况。结果表明,当添加量为6.0 mg/mL时,解冻后0 h精子活率与对照无差异显著,解冻后1、23、h精子活率与对照组差异显著(P<0.05)。当VC的添加量为4.0 mg/mL时,解冻后0 h时X精子质膜完整率显著高于对照组(P<0.05),解冻后1 h与对照相比差异不显著(P>0.05),但数值依然高于对照组。解冻后存放2、34、h与对照组相比差异显著。添加量为6.0 mg/mL时,解冻后0 h时X精子顶体完整率显著高于对照组(P<0.05),解冻后1、3 h精子顶体完整率与对照组相比差异显著(P<0.05),24、h与对照相比差异不显著(P>0.05),但顶体完整率高于对照组。在冷冻精液稀释液中VC的适宜添加量为4～6 mg/mL,此浓度下可有效提高荷斯坦公牛X精子解冻后活率、质膜完整率及顶体完整率。

精子研究的有力工具——软X射线显微术

软X射线显微术是利用软X射线作为光源的显微成像技术 ,填补了光学和电子显微学之间的空白。与可见光显微镜相比 ,软X射线显微镜具有更高的成像分辨率 ;与电子显微镜相比 ,它具有的优势是能对较厚 (生物样品厚度可达 10 μm)、含水的自然状态下的样品直接成像 ,而无须对样品进行脱水、超薄切片和染色等处理。另外 ,软X射线显微术还可以用于生物样品内的元素分布和蛋白质、DNA等生物大分子的分析研究。本文简要介绍了软X射线显微术在生物学研究中的优势 ;

水牛精液中X和Y精子比率的鉴定

利用流式细胞仪分析水牛分离和未分离精液中精子的DNA含量,所得的直方图用高斯曲线拟合,分析计算出样本中X和Y精子的比率。结果表明:未分离的水牛精液中X精子的比率为50%,与正常水牛后代性别比率没有显著差异;而水牛的分离X精液样本中X精子占93%,分离Y精液样本中Y精子占89%。实验结果显示了流式细胞仪DNA分析法鉴定水牛精液中X和Y精子比率的可靠性,而流式细胞仪分离精子程序和方法在水牛上的应用是可靠而有效的。

不同剂量X射线对人外周血有核细胞DNA及精子DNA损伤的比较

目的:应用单细胞凝胶电泳技术检测不同剂量X射线对人离体外周血有核细胞DNA及精子DNA的损伤,评估外周血有核细胞及精子在高剂量X射线照射后DNA的损伤程度。方法:采用血常规正常的人外周血和采集精液常规正常的人精液,用能量为6MV的X射线给予0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy,10Gy的剂量照射。照射后1h内进行单细胞凝胶电泳检测人离体外周血中有核细胞和人离体精液中精子的彗星率、慧尾长度和尾巴DNA含量。结果:0Gy对照组人离体外周血中有核细胞的彗星率和离体精液中精子的彗星率分别是1.00%±0.10%2、.1%±1.5%,有统计学差异(υ=18t,=2.31>1.734,P<0.05);2Gy组人离体外周血中有核细胞的彗星率和精液中精子的彗星率分别是27.10%±4.71%、47.37%±8.32%,有统计学差异(υ=18t,=6.76>1.734,P<0.05);4Gy组人离体外周血中有核细胞的彗星率和精液中精子的彗星率分别是76.32%±10.28%、92.22%±9.02%,有统计学差异(υ=18t,=3.68<1.734,P<0.05);6Gy组人离体外周血中有核细胞的彗星率和精液中精子的彗星率分别是94.36%±3.24%1、00%有统计学差异(υ=18t,=5.508>1.734,P<0.05);8Gy1、0Gy组人离体外周血中有核细胞的彗星率和精液中精子的彗星率都分别是100%1、00%无统计学差异。结论:实验足以佐证在一定剂量范围内(2～6Gy)精子彗星实验比人离体外周血中单个核细胞彗星实验能更敏感的反映X射线对人体的损伤。

X射线辐照引起GC1小鼠精原细胞凋亡诱导因子核转位并诱导其凋亡

目的研究X射线辐照后GC1小鼠精原细胞凋亡诱导因子(AIF)细胞定位的变化。方法 GC1细胞分别给予0、3、6、9 Gy X射线辐照,溴脱氧尿苷(Brd U)掺入实验检测辐照对细胞增殖速率的影响;辐照后48 h,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞核凝集情况,免疫荧光细胞化学染色检测胞质及胞核中AIF蛋白定位的变化,Western blot法分析细胞总蛋白、胞质蛋白及核提取物中AIF蛋白的水平。结果随着辐照剂量的增加,GC1细胞增殖速率显著减慢,细胞活性降低。6 Gy X射线辐照后全细胞提取物中AIF蛋白总量变化不大,但细胞核提取物中AIF显著增多,即AIF出现核转位的现象。结论 X射线辐照能够诱导小鼠精原细胞发生凋亡,该过程中伴有AIF入核的现象。

S-HPM辐射致牛X,Y精子的损伤差异研究

目的探讨S-HPM辐射致X、Y精子的损伤及其差异。方法经流式分选得到高纯度的牛X、Y精子,经30 mW/cm2和100 mW/cm2的S-HPM辐射4 min,通过精子动态分析系统检测辐射后1 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h的X精子和Y精子的活动度的差别;吖啶橙/溴化乙啶(acridine orange/ethidium bromide,AO/EB)染色检测辐射后1 h、6 h、12 h和24 h的X精子和Y精子凋亡率的变化。透射电镜观察100 mW/cm2S-HPM辐射后4 h X、Y精子超微结构损伤程度的差异。顶体酸性磷酸酶染色检测辐射后1 h、6 h和12 h顶体功能的变化差异。结果经30 mW/cm2和100 mW/cm2的S-HPM辐射后,精子活动度均随时间延长呈降低趋势,X、Y精子活动度的降低未见显著性差别(P>0.05)。S-HPM辐射可致X、Y精子凋亡率增加,呈现Y精子重于X精子,100 mW/cm2重于30 mW/cm2的趋势,其中早期具有显著性差异(P<0.05)。超微结构显示S-HPM辐射后精子以头部病变为主,尾部病变不明显,Y精子损伤重于X精子。S-HPM辐射后精子顶体酸性磷酸酶含量降低,Y精子重于X精子,100 mW/cm2重于30 mW/cm2(P<0.05,P<0.01)。结论 S-HPM辐射后X、Y精子均发生损伤,以精子头部病变为主,精子顶体酸性磷酸酶含量降低,Y精子的损伤重于X精子。

应用X精子冷冻精液生产体内性控胚胎的试验

采用CIDR+FSH+PG法对206头优秀荷斯坦供体母牛进行超数排卵,其中实验组73头超排后用X性控冷冻精液输精(每头3支),获可用胚310枚,头均可用胚4.25枚;对照组133头,采用常规冷冻精液输精(每头3支),获得可用胚787枚,头均可用胚5.92枚,差异不显著。结果表明,用已分离的X精子冷冻精液对超排母牛进行人工授精生产体内性控胚胎是可行的。

肿瘤-睾丸抗原SPANX-C基因mRNA在肝细胞癌中的表达及HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的:检测肿瘤-睾丸抗原SPANX-C基因在肝细胞癌(HCC)中的表达,预测SPANX-C/HLA-A2限制性CTL表位.为HCC的免疫治疗寻找新的靶位.方法:用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法对HCC患者癌组织、相应癌旁组织和对照组织(肝硬化和正常肝组织)中的SPANX-C基因mRNA进行检测,随机选取RT-PCR阳性扩增产物进行序列测定;用超基序法和量化基序法联合预测SPANX-C/HLA-A2限制性CTL表位.结果:在所检测的115例HCC组织中有70例(60.9%)表达SPANX-C基因mRNA,癌旁组织和20例对照肝组织均不表达.SPANX-C基因的表达与肿瘤分期、肿瘤分化程度、血清甲胎蛋白(AFP)水平等临床指标无相关性(P>0.05).用基序预测法筛选出5个HLA-A2限制性CTL表位(9肽),其中SPANX-C51-59(LVVRYRRNV)与HLA-A2分子具有较高结合力.结论:SPANX-C基因mRNA在HCC组织中呈高频率特异性表达,并存在HLA-A2限制性CTL表位,有望用于HCC的免疫治疗.

乳牛精子细胞核可被精确地分成类似于X,Y精子的两个群体

由于哺乳动物雄性配子(精子)有性染色体的差异,使哺乳动物X、Y精子在质量或密度上存在着微小的差别。因此,长期以来人们试图将两性精子分开,以人的意志控制动物性别,按人类的需要进行畜牧业生产。但是由于精于之间发育上的差异所引起的质量差掩盖了染色质的微弱差异,从而难以达到理想的分离效果。本实验先将两性精子共有的顶体和尾部去掉,以突出X、Y染色质的质量差异,再将精子细胞核在氯化铯密度梯度离心下分成两个核群区带。该实验为X、Y精于分离效果的鉴定提供了一种有效的方法。

Sry基因探针FISH检测奶牛XY精子纯度

为探讨荧光原位杂交技术(FISH)在评价奶牛精子纯度方面的应用价值,制备地高辛标记Sry基因探针,对分选X、Y精子及常规精子标本进行RNA水平的精子荧光原位杂交分析。结果显示,荧光原位杂交测定分选X、Y精子及常规精子纯度分别为94.6%、93.3%、50.3%,与对应精子纯度比较差异不显著(P>0.05),杂交信号多出现在精子尾部中段。可见:建立的Sry基因探针FISH方法评价奶牛精子纯度鉴定结果准确可靠,为其他精子纯度评价方法提供可靠的技术支持。

不同剂量X射线对雄性大鼠精子顶体酶活性的影响

目的:检测不同剂量X-射线对雄性大鼠精子顶体酶的影响,以探讨体外X-射线对大鼠精子顶体酶活性的影响。方法:将10周龄成熟雄性大鼠40只,随机分为4组:2Gy、4Gy、6Gy照射组和0Gy对照组;每组10只。按不同剂量照射,1h后处死大鼠,以改良的Kennedy法分别测定不同剂量X射线作用下的精子顶体酶活性。结果:2Gy、4Gy、6Gy照射组与0Gy对照组相比顶体酶活性显著降低(P<0.05),照射组酶活性较0Gy对照组有显著降低;4Gy、6Gy照射组与2Gy照射组相比较顶体酶活性显著降低(P<0.05);而4Gy照射组与6Gy照射组相比较则无统计学意义。结论:X-射线对大鼠精子顶体酶有明显的抑制作用。

利用分离的奶牛X精子冷冻精液生产体内性控胚胎试验

采用常规精液和分离的X精子冷冻精液对115头超数排卵的青年和经产荷斯坦母牛人工输精生产体内性控胚胎。结果表明,利用2支和3支性控精液给超排青年母牛输精,头均分别获得6.8枚±4.8枚和6.3枚±3.2枚可用胚胎,与常规精液的超排效果(7.2枚±5.2枚)无明显差异;利用2支和3支性控精液给超排经产母牛输精,头均可用胚胎分别为7.5枚±4.5枚和8.6枚±5.6枚,与常规精液的超排效果(6.1枚±3.2枚)相比,分别增加23%(P>0.05)和41%(P>0.05),无显著差异,但解冻后性控精子会明显影响经产母牛的受精率;对用性控精液输精生产的12枚抽样胚胎采用LAMP法进行性别鉴定并移植,结果获得了91.7%的雌性率和36.4%的受胎率。结果提示,X精子的分离过程会在一定程度上影响受精率,用分离的X精子冷冻精液对超排母牛进行人工授精生产体内性控胚胎是可行的。

性控奶山羊精液X和Y精子分离比例检测方法的建立

旨在建立可以定量计算奶山羊精液中X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法,用以检测经过分离的奶山羊精液X和Y精子的数量和比例,为性控技术的开发和生产应用提供技术支撑。本研究选择X、Y染色体中特异基因F9及ZFY片段设计引物,建立标准曲线,优化荧光定量PCR反应体系和条件。通过对阳性标准品梯度稀释以及对60支已知纯度的性控精液进行测定(3次重复)来检验方法的敏感性和可靠性。结果显示,所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,X和Y精子检测灵敏性分别为47和51 copies·μL~(-1);利用该方法对商品化的奶山羊性控冷冻精液中X和Y精子的数量和比例进行计算,其结果与销售公司提供的X和Y精子的纯度无显著差异(P>0.05),表明该方法结果可靠。本研究建立的计算奶山羊X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,灵敏度高,结果可靠,为计算奶山羊精液分离后X、Y精子数量及比例提供了快速可靠的方法。

鱼类精子遗传失活的X射线诱导

利用X射线对鲤鱼精子进行不同照射时间的处理,然后将处理后的精子与正常鲤鱼卵进行授精试验,以检测X射线对鲤鱼精子遗传物质的灭活效果。X射线强度为100kV,5mA,源距10cm,照射时间为0、20、30、40、50、60、70和80min。随着照射时间的增加,在0～50min之间,总出苗率呈逐步下降趋势,而在50～60min之间,总出苗率又呈升高趋势,超过60min,总出苗率又呈逐步下降趋势,表现出明显的"Hertwig效应";另一方面,随照射时间的增加,正常苗率逐步下降,而鱼苗畸形率逐步升高,照射50min以上,鱼苗畸形率均为100%。结果表明,在强度为100kV,5mAX射线管照射下,照射时间为60min时,鱼苗畸形率为100%且出苗率最高,是灭活鲤鱼精子和获得雌核发育单倍体的最佳照射时间。本文填补了近年来定量研究X射线灭活精子遗传物质的空白,为应用X射线诱导鱼类雌核发育的进一步深入研究奠定基础。

低剂量梅花鹿XY精子马花杂交人工授精试验

采用流式细胞分离仪分离的梅花鹿X和Y型冷冻精液与常规冻精对62头3组同期化处理的马鹿进行直肠把握人工授精。结果表明,0.25 mL/支含106个有效精子的X和Y型冻精产仔率分别为43%和37%,而0.25 mL/支含107个有效精子的常规冻精产仔率为55%,X、Y型冻精与常规冻精组间差异显著(P<0.05),所产后代性别比率分别为0∶10,9∶0和5∶6,X、Y型冻精与常规冻精组间差异显著(P<0.05),X、Y型冻精与常规冻精所产后代出生及60 d时的体重差异不显著(P>0.05)。

奶牛X性控冻精应用效果试验

选用120头奶牛,随机分为两组,各60头,用X性控冻精和普通冻精授配奶牛,统计情期受胎率和母犊率。结果表明,试验组比对照组情期受胎率低8.3个百分点(P>0.05),母犊率提高43.8个百分点(P<0.01)。