X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1通过自噬途径调控Caspase 1介导的胃肠道间质瘤细胞焦亡

目的:探究X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)对人胃肠道间质瘤(GIST)细胞中半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase 1)介导的细胞焦亡的影响及机制。方法:实时荧光定量PCR和Western blot检测人正常胃黏膜上皮细胞系(RGM-1)和GIST细胞系(GIST-T1、GIST-430、GIST-882)中XAF1的表达水平;采用脂质体介导转染法将pcDNA3.1-XAF1重组质粒染进GIST-882细胞,以构建高表达XAF1的GIST-882细胞。GIST-882细胞分为对照组、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空载体质粒)、pcDNA3.1-XAF1组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒)、pcDNA3.1-XAF1+Rap组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒并给予自噬激活剂雷帕霉素处理),免疫荧光染色检测各组细胞内微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,Western blot检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与Beclin1蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞上清中白细胞介素,IL-1β、IL-18含量,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测各组细胞LDH释放率,Western blot检测各组细胞中Caspase-1及其活化形式cleaved-Caspase-1、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平。结果:与RGM-1细胞比较,GIST-T1、GIST-430、GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);细胞转染后,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量均显著高于pcDNA3.1组、对照组(P<0.05)。与对照组比较,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显减弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著减少(P<0.05),细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著升高(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著增加(P<0.05);与pcDNA3.1-XAF1组比较,pcDNA3.1-XAF1+Rap组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显增强,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著增加(P<0.05),同时,细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著下降(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著减少(P<0.05)。结论:XAF1在GIST细胞中表达下降,提高XAF1表达能通过抑制自噬从而促进Caspase 1介导的GIST细胞焦亡,发挥抗肿瘤作用。

缺氧诱导因子-1α与X染色体连锁凋亡抑制蛋白在人卵巢癌中的表达及意义

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在人卵巢癌中的表达及意义。方法用免疫组织化学技术法检测人正常卵巢组织标本10例、良性卵巢肿瘤标本10例、交界性卵巢肿瘤标本10例及恶性卵巢癌组织标本30例中HIF-1α和XIAP的表达情况;培养人卵巢癌细胞系SKOV3,向细胞培养瓶中加入HIF-1α激动剂和抑制剂,提取细胞总RNA,用RT-PCR技术观察XIAP和HIF-1α基因表达变化。结果XIAP、HIF-1α在恶性上皮性卵巢癌组及交界性肿瘤组表达率均明显高于良性卵巢肿瘤组(P<0.05)。恶性上皮性卵巢癌组织中HIF-1α与XIAP在临床分期晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)组的阳性表达率明显高于临床分期早期(Ⅰ期和Ⅱ期)组(P<0.05),与患者年龄、病理分型和淋巴结转移无关(P>0.05)。在恶性上皮性卵巢癌中HIF-1α与XIAP呈正相关(P<0.05)。随缺氧时间延长,SKOV3细胞系中HIF-1αmRNA表达量渐增;低氧24 h时HIF-1αmRNA表达量达高峰,36 h时HIF-1αmRNA表达量有所回落;添加HIF-1α抑制剂雷帕酶素后,HIF-1αmRNA表达量明显减少,XIAPmRNA亦减少。SKOV3细胞系中XIAP mRNA随HIF-1αmRNA而变化。结论HIF-1α和XIAP可能参与了恶性卵巢肿瘤的发生;HIF-1α和XIAP的高表达可能提示预后不良;HIF-1α对XIAP可能存在调控作用,两者可能协同促进卵巢癌的发生。

虾夷马粪海胆X染色体连锁凋亡抑制蛋白XIAP基因克隆及不同病原微生物刺激后的表达响应

为研究X染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)在虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius(体质量为40~80 g)天然免疫系统中的作用,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得虾夷马粪海胆XIAP基因的cDNA序列,并通过实时定量PCR分析了其在各组织中的分布,以及经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)、强壮弧菌Vibrio fortis和葡聚糖(whole glucan particles,WGP)刺激后,XIAP基因在体腔细胞中的表达情况。结果表明:虾夷马粪海胆XIAP基因的cDNA长为4894 bp,其中,5′UTR为459 bp,开放阅读框为2331 bp,3′UTR为2104 bp,共编码776个氨基酸,具有3个BIR结构域和1个RING指环结构域,预测该蛋白相对分子质量为86960,等电点为5.96,为酸性蛋白;虾夷马粪海胆XIAP基因在检测的各组织中均有表达,其中,在卵巢中的表达量显著高于管足、体腔细胞、围口膜、肠和精巢(P<0.05);经PGN、LPS、Poly I:C、WGP和V.fortis刺激后,体腔细胞中的XIAP基因表达量显著上升(P<0.05),并在PGN、LPS和Poly I:C刺激后12 h,WGP刺激后24 h,V.fortis刺激后6 h时,XIAP基因表达量均达到最高值。研究表明,克隆获得的XIAP基因参与了虾夷马粪海胆的免疫应答,并在海胆的天然免疫中发挥重要作用。

环氧化酶2、X染色体连锁凋亡抑制蛋白在唾液腺恶性肿瘤中的表达及意义

目的:检测环氧化酶2(Cox-2)与X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在唾液腺腺样囊性癌(ACC)与黏液表皮样癌(MEC)中的表达,探讨两者在唾液腺恶性肿瘤发生、发展中的作用及相关性。方法:采用免疫组织化学SP法检测95例唾液腺恶性肿瘤(包括50例ACC、45例MEC)、10例多形性腺瘤及10例正常唾液腺组织中Cox-2和XIAP的表达情况,使用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理。结果:Cox-2、XIAP在唾液腺恶性肿瘤中高表达,在多形性腺瘤和正常唾液腺组织中不表达或低表达。Cox-2、XIAP的表达与唾液腺恶性肿瘤组织临床分期和远处转移呈正相关(P<0.05),而与肿瘤部位无相关性(P>0.05)。结论:Cox-2和XIAP在唾液腺恶性肿瘤中高表达,可能在唾液腺恶性肿瘤发生、发展过程中具有重要作用。

成年大鼠心肌缺血再灌注后X染色体连锁凋亡抑制蛋白的动态表达变化

目的 测定心肌缺血再灌注过程中X染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）动态表达变化,探讨其与缺血再灌注损伤所致心肌细胞凋亡的关系.方法 将健康成年雄性SD大鼠随机分为两组,手术组和伪手术组,每组根据再灌注时间再分为6组：缺血30min,再灌注0、1、2、3、12、24 h组.采用半胱天冬酶-3（Caapaae-3）活性检测判定大鼠心肌细胞凋亡发生情况;用Western Blot和实时定量PCR技术分别检测各组心肌组织中XIAP的蛋白和基因表达水平.结果 Caspase-3活性从心肌缺血再灌注1 h开始升高,再灌注12 h活性最大,再灌注24 h趋于正常.心肌缺血再灌注3 h,XIAP蛋白表达开始降低,再灌注12 h表达最低;而XIAP的mRNA水平表达各组差异无统计学意义.结论 成年大鼠心肌缺血再灌注后Caspase-3活性增高可能与XIAP表达降低有关,提示XIAP表达降低可能参与了心肌缺血再灌注诱导的细胞凋亡.

黄芩苷对海人酸致痫小鼠海马X染色体连锁凋亡抑制蛋白表达的影响

目的探讨黄芩苷对海人酸诱导的小鼠癫痫持续状态后海马组织X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响。方法将90只ICR雄性小鼠随机分为对照组、癫痫持续状态(SE)组、黄芩苷治疗组,每组30只;采用侧脑室注入海人酸建立小鼠癫痫持续状态模型。通过苏木素-伊红(HE)染色观察黄芩苷对小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞的形态学改变;应用免疫组化和Western blot方法检测小鼠海马组织中XIAP的表达量。结果黄芩苷明显改善SE后小鼠海马组织的病理形态学,海马CA3区XIAP在SE后6 h起逐渐增加,12 h达高峰,24 h有所下降;与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。黄芩苷治疗组海马XIAP蛋白表达在6 h、12 h和24 h均高于SE组(P<0.05)。结论黄芩苷对小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞的保护作用,可能与其促进XIAP的表达有关。

X-染色体连锁的凋亡抑制蛋白对新生小鼠脑缺氧缺血后细胞色素C释放的影响

目的探讨X-染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)对未成熟脑缺氧缺血(HI)后细胞色素C从线粒体释放的影响。方法新生9日龄转基因XIAP过度表达C57BL/6小鼠(XIAP组)及同期野生型9日龄C57BL/6小鼠(野生组)在HI后不同时间点处死取脑,部分脑组织进行手工匀浆后差速离心分离胞浆和线粒体成分进行Western蛋白印迹,部分脑组织进行细胞色素C免疫组化染色。结果Western蛋白印迹显示,HI后24h缺血侧脑组织线粒体中细胞色素C的含量较对侧减少,而胞浆中细胞色素C的含量较对侧增加(细胞色素C从线粒体释放);XIAP组脑组织线粒体中细胞色素C释放量明显少于野生组。免疫组化结果显示HI后3h、24h,XIAP组大脑皮层和海马CA1区细胞色素C阳性细胞数明显低于野生组。结论XIAP过度表达可抑制HI后细胞色素C从线粒体向胞浆的释放。

X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白与口腔鳞癌细胞Tca8113化疗耐药的关系

目的研究X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在口腔鳞癌细胞Tca8113中的表达水平,并探讨XIAP表达与Tca8113细胞对化疗药物耐药性之间的关系。方法用平阳霉素(PYM)间歇性加药,逐步递增剂量,采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测药物处理前后细胞对PYM的敏感性,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测XIAP在药物处理前后的各Tca8113细胞组中的表达变化,并探讨XIAP与细胞耐药性的关系。结果Tca8113细胞在PYM间断作用下产生耐受,Tca8113-1-10组、Tca8113-10-10组耐药细胞对PYM的半数有效浓度(IC50)分别为(12.758±0.030)、(18.986±0.150)μg·mL-1。Tca8113-1-20、Tca8113-10-20组耐药细胞对PYM的IC50分别为(26.302±0.072)、(35.294±0.115)μg·mL-1。XAIP的表达水平与细胞对PYM的耐药有相关性(P<0.01)。结论XIAP在口腔鳞癌中的表达水平升高,可能与鳞癌的化疗耐药性有关,这可作为口腔鳞癌基因治疗的一个新靶点。

CCCTC结合因子在HeLa细胞中调控X染色体连锁的凋亡抑制蛋白的表达

目的:确定HeLa细胞的CCCTC结合因子(CTCF)表达水平是否与细胞的抗凋亡能力相关,并研究其具体分子机制。方法:用顺铂和阿糖胞苷分别诱导HeLa细胞和CTCF敲降的HeLa-CTCF-II-11细胞凋亡,比较两者的凋亡率;用基因表达芯片检测CTCF敲降后HeLa细胞的表达谱变化,寻找并验证受CTCF调控的与凋亡相关的蛋白。结果:用顺铂和阿糖胞苷诱导后,HeLa-CTCF-II-11细胞的凋亡率显著高于HeLa细胞;HeLa细胞的CTCF敲降后,X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达显著下降。结论:CTCF敲降使HeLa细胞的抗凋亡能力下降,CTCF对XIAP基因的表达调控在这个过程中起了重要作用。

X染色体连锁凋亡抑制蛋白的研究进展

X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族中的重要一员,其主要由N末端3个杆状病毒IAP重复序列(BIR)和C末端一个锌指结构域组成,其主要通过与caspase相互作用抑制细胞凋亡,此外XIAP还可通过核因子κB途径和参与信号转导途径抑制细胞凋亡。XIAP的正向调节主要是在翻译过程中实现的,而负向调节则主要由Smac、转化生长因子β信号通路中的凋亡相关蛋白、HtrA、XIAP相关因子1凋亡抑制蛋白1等XIAP抑制分子实现。XIAP与肿瘤治疗研究方面,反义寡核苷酸技术、XIAP小分子抑制剂、RNA干扰技术等为治疗肿瘤提供了新的研究方向。

X连锁凋亡抑制蛋白在肝细胞癌中的研究进展

X连锁凋亡抑制蛋白是一种高度保守、广泛表达的蛋白,是凋亡抑制蛋白家族中的成员之一。X连锁凋亡抑制蛋白通过直接结合或泛素化降解半胱天冬酶以抑制其活性,从而拮抗凋亡受体及线粒体介导的细胞凋亡。肝细胞癌中X连锁凋亡抑制蛋白表达异常升高,可拮抗肝细胞癌细胞的凋亡,是肝细胞癌预后不良的重要因素。因此,通过抑制肝细胞癌细胞中X连锁凋亡抑制蛋白的表达,是一种潜在的有效治疗肝细胞癌的策略。正在开发的靶向X连锁凋亡抑制蛋白的药物有反义寡核苷酸和Samc类似物等。本文总结了靶向X连锁凋亡抑制蛋白药物治疗肝细胞癌的作用机制及研究进展,以期为肝细胞癌的药物开发和临床治疗提供理论依据。

siRNA抑制X连锁凋亡抑制蛋白基因对人HeLa细胞凋亡及周期的影响

目的：探讨特异性 siRNA 对宫颈癌 Hela 细胞 X 连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）基因的抑制作用及其抑制后细胞凋亡和细胞周期的变化。方法设计合成 XIAP 特异性抑制 siRNA，并将 Hela 细胞分成4组，即观察组（pG-PU6／GFP／Neo ／XIAP -siRNA 转染细胞）、空白组（未加 siRNA 及转染试剂）、NC 组（阴性对照，为所选目的序列被无序打乱的 siRNA 转染）、Mock 组（转染试剂对照，加转染试剂未加 siRNA）。RT-PCR 法检测各组 XIAP mRNA 表达情况，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况及细胞周期变化。结果转染48、72 h，观察组 XIAP mRNA 表达分别为20．20±0．10、19．99±0．14，空白组分别为21．43±0．04、20．95±0．15，两组比较均有统计学差异（P 均＜0．05）。转染48 h，观察组、空白组细胞凋亡率分别为（28．91±0．12）％、（9．73±0．02）％；转染72h，观察组、空白组细胞凋亡率分别为（37．29±0．10）％、（10．62±0．04）％；观察组细胞凋亡率均高于空白组（P 均＜0．05）。空白组、Mock组、NC 组间 XIAP mRNA 表达、细胞凋亡率比较均无统计学差异（P 均＞0．05）。与空白组相比，观察组转染48、72 h 后 G0～G1期细胞增多而 S 期细胞减少（P 均＜0．05）。结论特异性 XIAP-siRNA 可有效沉默宫颈癌 Hela 细胞XIAP 基因，抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。

α干扰素对结肠癌细胞株lovo和sw1116中X染色体连锁凋亡抑制相关因子1表达调节作用

目的:研究α干扰素(IFN-α)对结肠癌细胞株lovo和sw1116中X染色体连锁凋亡抑制相关因子1(XAF1)表达调节作用。方法:以不同浓度(250、125、62.5和0 U/ml)的IFN-α作用细胞,荧光素酶报道系统检测IFN-α对XAF1启动子活性的影响,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹等方法观察IFN-α对XAF1的mRNA和蛋白表达水平的影响。结果:IFN-α可提高XAF1启动子活性,在lovo和sw1116中分别达到61.7%和87.1%(P<0.05),同时在mRNA和蛋白水平上调XAF1表达,并呈剂量依赖关系(P<0.05)。结论:IFN-α可上调XAF1表达,提示XAF1可能是干扰素刺激基因(ISG)。

X染色体连锁的凋亡抑制蛋白及BNIP3在脑缺血再灌注损伤中作用的研究进展

脑缺血再灌注损伤（CIRI）,是指脑缺血导致组织坏死后血管再通,而缺血性损伤却进一步加重的现象,是脑血管疾病损伤的重要病理生理基础。CIRI的病理过程涉及细胞凋亡、自由基损伤、炎症反应、Ca-（2＋）超载、血-脑脊液屏障受损及兴奋性神经递质的释放等。

下调X连锁调亡抑制蛋白基因表达增强多西他赛诱导膀胱癌细胞凋亡的作用

目的:观察人源性膀胱癌细胞在下调X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因表达后,多西他赛对其敏感性的影响。方法:以shRNA和shRNA-XIAP质粒分别稳定转染人源性膀胱癌T24T细胞。以荧光显微镜观察转染细胞。以RT-PCR和Western blotting法分别检测膀胱癌细胞XIAPmRNA和蛋白的表达。与T24T以及转染空载体的T24T细胞相比较,以ATPase法检测多西他赛对转染XIAP基因的膀胱癌细胞的细胞毒性。相差显微镜下观察,流式细胞术检测多西他赛预处理转染XIAP基因的膀胱癌细胞的凋亡率;以Western blotting法检测细胞内的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)和caspase-3蛋白表达和裂解水平。结果:荧光显微镜下分别观察shRNA和shRNA-XIAP转染的T24T细胞,均见稳定荧光。Western blotting和RT-PCR检测结果显示,人源性膀胱癌T24T细胞在稳定转染反义XIAP基因后,其XIAP蛋白和mRNA水平均显著降低。经多西他赛处理24 h后,转染反义XIAP基因的T24T细胞IC_(50)为(1.23±0.62)nmol/L,远低于T24T以及转染空白载体的对照组细胞[(8.22±1.23)nmol/L,(8.35±0.98)nmol/L,P<0.01]。流式细胞术检测结果显示,T24T shRNA-XIAP细胞组(2 nmol/L和5nmol/L)凋亡率[(41.45±6.23)%和(74.82±5.46)%]显著高于转染空载体细胞的凋亡率[(25.34±3.81)%和(34.14±6.25)%,P<0.01]。与转染空载体的细胞相比较,T24T shRNA-XIAP细胞内的PARP和caspase-3明显降低。结论:下调膀胱癌细胞的XIAP基因表达后,可显著增强化疗药物多西他赛所诱导的膀胱癌细胞的凋亡,并增强多西化赛的细胞毒性。

X染色体相关凋亡抑制蛋白及P53在卵巢上皮肿瘤的表达及意义

p53基因是较早被认识的肿瘤抑制基因，是重要的细胞周期的调节及凋亡基因。p53基因的突变、缺失、失活广泛存在于各种肿瘤中。由于p53基因编码序列的改变，可导致野生型P53蛋白功能的丧失，突变型P53蛋白在细胞内蓄积．进而可导致细胞的恶性转化。

X染色体连锁的凋亡抑制蛋白对米非司酮诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的观察X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP蛋白)对米非司酮诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。方法 XIAP重组质粒转染HeLa细胞,共聚焦显微镜观察其在细胞内的分布;流式细胞仪检测米非司酮处理和未处理的各组细胞凋亡率。结果 XIAP在HeLa细胞中弥漫分布于细胞核和细胞浆,米非司酮可诱导HeLa细胞凋亡,XIAP能抑制由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡。结论米非司酮能促进HeLa细胞凋亡,XIAP能抑制由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡。

基于X连锁凋亡抑制蛋白/第二种线粒体衍生半胱天冬酶激活剂通路探讨尼莫地平对脑梗死大鼠神经功能的影响

目的基于X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)/第二种线粒体衍生半胱天冬酶激活剂(Smac)通路探讨尼莫地平对脑梗死大鼠神经功能的影响。方法以线栓法闭塞大鼠大脑中动脉诱导建立大鼠脑梗死模型,随机分为模型组、尼莫地平组(10 mg/kg)、AT-406组(XIAP抑制剂,7 mg/kg)、联合组(尼莫地平联合AT-406),每组12只,另取12只大鼠设定为假手术组,分别给药干预后,以Zea Longa分级法对各组大鼠神经功能缺损进行评分;以Morris水迷宫实验评测各组大鼠学习记忆功能通过比较其跨越原平台次数;以TTC染色检测各组大鼠脑梗死状况;以TUNEL染色评测各组大鼠海马神经元凋亡状况;以试剂盒检测各组大鼠血清促炎因子环氧化酶-2(COX-2)与白细胞介素-18(IL-18)含量;以蛋白免疫印迹法检测各组大鼠脑组织凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]与XIAP/Smac通路相关蛋白(XIAP、Smac)表达状况。结果与假手术组相比,模型组大鼠跨越原平台次数、脑组织Bcl-2与XIAP表达水平显著降低(P<0.05),神经功能缺损评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡比率、血清COX-2与IL-18含量、脑组织Bax与Smac表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组、联合组分别相比,尼莫地平组大鼠跨越原平台次数、脑组织Bcl-2与XIAP表达水平均升高(P<0.05),神经功能缺损评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡比率、血清COX-2与IL-18含量、脑组织Bax与Smac表达水平均降低(P<0.05)。与模型组、联合组分别相比,AT-406组大鼠脑组织跨越原平台次数、脑组织Bcl-2与XIAP表达水平均降低(P<0.05),神经功能缺损评分、脑梗死面积、海马神经元凋亡比率、血清COX-2与IL-18含量、脑组织Bax与Smac表达水平均升高(P<0.05)。结论尼莫地平可通过上调XIAP表达,下调Smac表达,进而抑制炎症,减轻脑梗死大鼠海马神经元凋亡,提升大鼠学习记忆能力,改善其神经功能。

针康法对脑缺血大鼠缺血半暗区细胞凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白和cleaved-caspase-9蛋白表达的影响

目的观察针康法对脑缺血大鼠缺血半暗区细胞凋亡及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)和cleaved-caspase-9蛋白表达的影响。方法选取180只雄性Sprague-Dawley大鼠,通过随机数字表法随机分为假手术组、模型组、针刺组、康复组和针康组。每组再分为3 d、7 d和14 d三个亚组(n=12)。采用改良Longa线栓法进行造模,假手术组和模型组不予治疗,针刺组进行头穴丛刺治疗,康复组进行跑台康复训练,针康组进行针康法治疗。术后各时间点对大鼠进行改良神经功能缺损评分(mNSS)后取材,采用TUNEL染色观察大鼠脑缺血半暗区细胞凋亡率,Western blotting检测脑缺血半暗区XIAP和cleaved-caspase-9蛋白表达。结果术后各时间点,与模型组比较,各治疗组mNSS评分均降低(P<0.05),细胞凋亡率均降低(P<0.05),XIAP蛋白表达上调(P<0.05),cleaved-caspase-9蛋白表达下调(P<0.05);与针刺组、康复组比较,针康组细胞凋亡率进一步降低(P<0.05),XIAP蛋白表达进一步上调(P<0.05)。术后7 d、14 d,针康组mNSS评分进一步降低(P<0.05),针康组cleaved-caspase-9蛋白表达进一步下调(P<0.05)。结论针康法能降低脑缺血大鼠神经功能缺损,优于单独的头穴丛刺和康复训练,其机制可能与促进XIAP蛋白表达,抑制caspase-9蛋白活化,从而减少细胞凋亡有关。

X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的克隆及其转录活性检测

目的:X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1能够诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3凋亡,其具体转录调控机制尚不十分清楚。克隆X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子,检测干扰素对其转录活性的影响。方法:实验于2006-05/2007-07在香港大学分子生物学研究所和洛阳华美生物工程公司完成。①材料:结肠癌细胞株Lovo和Sw1116来自美国AmericanTypeCultureCol-lection。pGL3basic载体,内参照pRL-CMV载体和Dual-luciferasereporterKit,T4DNA连接酶,限制性内切酶KpnI和XhoI均由Promega公司提供。②实验方法:采用PCR法扩增获得X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因的启动子片段,将之定向克隆到含荧光素酶报告基因的pGL3basic载体上,获得的报告基因质粒命名为pLUC107,瞬时转染Lovo和Sw1116细胞株,经α-干扰素刺激处理,启动子转录活性用荧光素酶相对表达活性表示。结果:①PCR扩增结果:在预期的271bp处出现清晰DNA片段,无非特异扩增现象,证明其为X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的PCR扩增产物。②重组质粒的酶切鉴定及测序:重组质粒pLUC107双酶切后可见约为271bp的DNA片段,与理论值相一致。DNA测序证实含X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功。③干扰素对X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子转录活性的影响:与未经α-干扰素处理的含pLUC107的Lovo和Sw1116细胞的荧光素酶相对活性值比较,经α-干扰素处理后两种细胞的荧光素酶相对活性值均明显升高(P均<0.05),且升高幅度与α-干扰素呈剂量依赖性。结论:成功克隆出X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子片段,并利用荧光素酶报告基因证实α-干扰素可上调其转录活性。