乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因5的克隆

目的:为了阐明乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病的发病机制,筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白HBx反式激活新型靶基因. 方法:以HBV X蛋白(HBx)表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,确定新型基因序列并命名为XTP5.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列. 结果:XTP5基因的编码基因序列全长为1 527个核苷酸(nt),编码产物由508个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HBx是一种由病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.应用SSH技术发现了HBx反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HBx蛋白的反式激活作用及其机制, 开辟了新的研究方向.

人类HBxAg蛋白反式激活基因5的原核表达及其蛋白纯化

为了更深入研究XTP5蛋白(也称人类次要组织相容性抗原(mHA-8))的生物学功能,以HepG2细胞总RNA为模板、应用RT-PCR技术获得XTP5基因,再利用基因工程技术对其进行克隆和原核重组表达载体构建和诱导表达,成功克隆XTP5基因,并成功构建原核重组表达空载体pET-32a(+)-XTP5;阳性重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21后,在37℃经终浓度1 mmoL/L IPTG诱导5 h后,受体菌大量表达76.88 ku XTP5重组蛋白;West-ern-blot证实宿主菌表达的蛋白特异性好;肝素亲和层析柱纯化表达产物XTP5蛋白效果良好。结果表明,成功克隆了人类XTP5基因,并获得纯度较高的融合蛋白XTP5。

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因4在HepG2细胞凋亡中的作用及其机制

目的探讨在肝母细胞瘤HepG2细胞凋亡中乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因4(XTP4)的作用及其机制。方法在HepG2细胞中瞬时转染XTP4的表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-XTP4及XTP4基因的小干扰RNA及各自的阴性对照,48h后用蛋白质印迹法检测在HepG2细胞中XTP4的过表达和干扰表达情况;流式细胞术检测HepG2细胞凋亡;蛋白质印迹法检测各组HepG2细胞中凋亡相关蛋白P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达水平,并计算Bcl-2/Bax比值;化学发光法检测HepG2细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的活性。计量资料以均值±标准差表示,两组间比较采用独立样本t检验。结果在HepG2细胞中成功实现XTP4蛋白的过表达和干扰表达。与对照组相比,在HepG2细胞中过表达XTP4可以使凋亡细胞数显著减少(P<0.05),Bcl-2/Bax比值增高(P<0.05),P53蛋白表达降低(P<0.05),Caspase-3蛋白表达降低,Caspase-3活性下降(P<0.05);而在HepG2细胞中用干扰RNA抑制XTP4表达可以使凋亡细胞数显著增加(P<0.05),Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05),P53蛋白表达增加(P<0.05),Caspase-3蛋白表达增加,Caspase-3活性上升(P<0.05)。结论在HepG2细胞凋亡中XTP4具有抑制作用,其抑制HepG2细胞凋亡的作用可能是通过调节Bcl-2/Bax比值实现,P53蛋白可能参与其中。