X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的克隆及其转录活性检测

目的:X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1能够诱导半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3凋亡,其具体转录调控机制尚不十分清楚。克隆X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子,检测干扰素对其转录活性的影响。方法:实验于2006-05/2007-07在香港大学分子生物学研究所和洛阳华美生物工程公司完成。①材料:结肠癌细胞株Lovo和Sw1116来自美国AmericanTypeCultureCol-lection。pGL3basic载体,内参照pRL-CMV载体和Dual-luciferasereporterKit,T4DNA连接酶,限制性内切酶KpnI和XhoI均由Promega公司提供。②实验方法:采用PCR法扩增获得X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因的启动子片段,将之定向克隆到含荧光素酶报告基因的pGL3basic载体上,获得的报告基因质粒命名为pLUC107,瞬时转染Lovo和Sw1116细胞株,经α-干扰素刺激处理,启动子转录活性用荧光素酶相对表达活性表示。结果:①PCR扩增结果:在预期的271bp处出现清晰DNA片段,无非特异扩增现象,证明其为X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子的PCR扩增产物。②重组质粒的酶切鉴定及测序:重组质粒pLUC107双酶切后可见约为271bp的DNA片段,与理论值相一致。DNA测序证实含X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子荧光素酶报告基因质粒构建成功。③干扰素对X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1启动子转录活性的影响:与未经α-干扰素处理的含pLUC107的Lovo和Sw1116细胞的荧光素酶相对活性值比较,经α-干扰素处理后两种细胞的荧光素酶相对活性值均明显升高(P均<0.05),且升高幅度与α-干扰素呈剂量依赖性。结论:成功克隆出X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1基因启动子片段,并利用荧光素酶报告基因证实α-干扰素可上调其转录活性。

X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1通过自噬途径调控Caspase 1介导的胃肠道间质瘤细胞焦亡

目的:探究X-染色体连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)对人胃肠道间质瘤(GIST)细胞中半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase 1)介导的细胞焦亡的影响及机制。方法:实时荧光定量PCR和Western blot检测人正常胃黏膜上皮细胞系(RGM-1)和GIST细胞系(GIST-T1、GIST-430、GIST-882)中XAF1的表达水平;采用脂质体介导转染法将pcDNA3.1-XAF1重组质粒染进GIST-882细胞,以构建高表达XAF1的GIST-882细胞。GIST-882细胞分为对照组、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空载体质粒)、pcDNA3.1-XAF1组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒)、pcDNA3.1-XAF1+Rap组(转染pcDNA3.1-XAF1重组质粒并给予自噬激活剂雷帕霉素处理),免疫荧光染色检测各组细胞内微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,Western blot检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值与Beclin1蛋白表达水平,ELISA法检测各组细胞上清中白细胞介素,IL-1β、IL-18含量,乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测各组细胞LDH释放率,Western blot检测各组细胞中Caspase-1及其活化形式cleaved-Caspase-1、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)蛋白表达水平。结果:与RGM-1细胞比较,GIST-T1、GIST-430、GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);细胞转染后,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞中XAF1 mRNA和蛋白相对表达量均显著高于pcDNA3.1组、对照组(P<0.05)。与对照组比较,pcDNA3.1-XAF1组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显减弱,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著减少(P<0.05),细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著升高(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著增加(P<0.05);与pcDNA3.1-XAF1组比较,pcDNA3.1-XAF1+Rap组GIST-882细胞内LC3荧光强度明显增强,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin1蛋白相对表达量显著增加(P<0.05),同时,细胞上清液IL-1β、IL-18含量及LDH释放率显著下降(P<0.05),Caspase-1、cleaved-Caspase-1、NLRP3、GSDMD蛋白相对表达量也显著减少(P<0.05)。结论:XAF1在GIST细胞中表达下降,提高XAF1表达能通过抑制自噬从而促进Caspase 1介导的GIST细胞焦亡,发挥抗肿瘤作用。

X-染色体相关凋亡抑制蛋白相关因子1抑制肝癌细胞增殖和诱导凋亡的实验研究

目的研究X-染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)相关因子1(XAF1)对肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法构建正义pcDNA3～XAF1和反义pcDNA3-XAF1-AS质粒,通过脂质体转染技术将质粒DNA转入SMMC7721肝癌细胞株并建立稳定高表达XAF1的肝癌细胞克隆。应用MTT、流式细胞仪、TUNEL法检测肝癌细胞的增殖和凋亡；应用RT-PCR和Western印迹法检测基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果XAF1在SMMC7721肝癌细胞株中有表达,但低于正常肝脏细胞水平。稳定高表达XAF1基因可抑制肝癌细胞的增殖和诱导凋亡,并能增加其对化疗药物5-氟尿嘧啶和羟基喜树碱的敏感性。结论XAF1能抑制肝癌细胞增殖和诱导其凋亡。

X染色体相关凋亡抑制蛋白及P53在卵巢上皮肿瘤的表达及意义

p53基因是较早被认识的肿瘤抑制基因，是重要的细胞周期的调节及凋亡基因。p53基因的突变、缺失、失活广泛存在于各种肿瘤中。由于p53基因编码序列的改变，可导致野生型P53蛋白功能的丧失，突变型P53蛋白在细胞内蓄积．进而可导致细胞的恶性转化。

X-染色体连锁的凋亡抑制蛋白对新生小鼠脑缺氧缺血后细胞色素C释放的影响

目的探讨X-染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)对未成熟脑缺氧缺血(HI)后细胞色素C从线粒体释放的影响。方法新生9日龄转基因XIAP过度表达C57BL/6小鼠(XIAP组)及同期野生型9日龄C57BL/6小鼠(野生组)在HI后不同时间点处死取脑,部分脑组织进行手工匀浆后差速离心分离胞浆和线粒体成分进行Western蛋白印迹,部分脑组织进行细胞色素C免疫组化染色。结果Western蛋白印迹显示,HI后24h缺血侧脑组织线粒体中细胞色素C的含量较对侧减少,而胞浆中细胞色素C的含量较对侧增加(细胞色素C从线粒体释放);XIAP组脑组织线粒体中细胞色素C释放量明显少于野生组。免疫组化结果显示HI后3h、24h,XIAP组大脑皮层和海马CA1区细胞色素C阳性细胞数明显低于野生组。结论XIAP过度表达可抑制HI后细胞色素C从线粒体向胞浆的释放。

X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白与口腔鳞癌细胞Tca8113化疗耐药的关系

目的研究X-性染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在口腔鳞癌细胞Tca8113中的表达水平,并探讨XIAP表达与Tca8113细胞对化疗药物耐药性之间的关系。方法用平阳霉素(PYM)间歇性加药,逐步递增剂量,采用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测药物处理前后细胞对PYM的敏感性,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测XIAP在药物处理前后的各Tca8113细胞组中的表达变化,并探讨XIAP与细胞耐药性的关系。结果Tca8113细胞在PYM间断作用下产生耐受,Tca8113-1-10组、Tca8113-10-10组耐药细胞对PYM的半数有效浓度(IC50)分别为(12.758±0.030)、(18.986±0.150)μg·mL-1。Tca8113-1-20、Tca8113-10-20组耐药细胞对PYM的IC50分别为(26.302±0.072)、(35.294±0.115)μg·mL-1。XAIP的表达水平与细胞对PYM的耐药有相关性(P<0.01)。结论XIAP在口腔鳞癌中的表达水平升高,可能与鳞癌的化疗耐药性有关,这可作为口腔鳞癌基因治疗的一个新靶点。

肾细胞癌中X染色体相关的凋亡抑制蛋白的表达与细胞凋亡的关系

目的 :探讨X染色体相关的凋亡抑制蛋白 (XIAP)在肾细胞癌中的表达及其与细胞凋亡的关系。方法 :应用免疫组织化学技术和DNA原位末端标记技术 (TUNEL)检测 2 8例肾细胞癌中XIAP的表达与细胞凋亡。结果 :2 8例肾细胞癌XIAP阳性率为 5 7.1% ,9例正常肾组织XIAP阳性率为 11.1% ,差异有统计学意义 (P<0 .0 1)。XIAP表达与肾细胞癌病理类型、病理分期和病理分级无明显相关 (P >0 .0 5 )。XIAP表达与AI呈负相关 (P <0 .0 1)。结论 :XIAP在肾细胞癌中表达对判断肾细胞癌的生物学特性无明显价值 ,但却为靶向XIAP的抗肾细胞癌治疗提供了理论依据。

环氧化酶2、X染色体连锁凋亡抑制蛋白在唾液腺恶性肿瘤中的表达及意义

目的:检测环氧化酶2(Cox-2)与X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在唾液腺腺样囊性癌(ACC)与黏液表皮样癌(MEC)中的表达,探讨两者在唾液腺恶性肿瘤发生、发展中的作用及相关性。方法:采用免疫组织化学SP法检测95例唾液腺恶性肿瘤(包括50例ACC、45例MEC)、10例多形性腺瘤及10例正常唾液腺组织中Cox-2和XIAP的表达情况,使用SPSS17.0软件包对数据进行统计学处理。结果:Cox-2、XIAP在唾液腺恶性肿瘤中高表达,在多形性腺瘤和正常唾液腺组织中不表达或低表达。Cox-2、XIAP的表达与唾液腺恶性肿瘤组织临床分期和远处转移呈正相关(P<0.05),而与肿瘤部位无相关性(P>0.05)。结论:Cox-2和XIAP在唾液腺恶性肿瘤中高表达,可能在唾液腺恶性肿瘤发生、发展过程中具有重要作用。

成年大鼠心肌缺血再灌注后X染色体连锁凋亡抑制蛋白的动态表达变化

目的 测定心肌缺血再灌注过程中X染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）动态表达变化,探讨其与缺血再灌注损伤所致心肌细胞凋亡的关系.方法 将健康成年雄性SD大鼠随机分为两组,手术组和伪手术组,每组根据再灌注时间再分为6组：缺血30min,再灌注0、1、2、3、12、24 h组.采用半胱天冬酶-3（Caapaae-3）活性检测判定大鼠心肌细胞凋亡发生情况;用Western Blot和实时定量PCR技术分别检测各组心肌组织中XIAP的蛋白和基因表达水平.结果 Caspase-3活性从心肌缺血再灌注1 h开始升高,再灌注12 h活性最大,再灌注24 h趋于正常.心肌缺血再灌注3 h,XIAP蛋白表达开始降低,再灌注12 h表达最低;而XIAP的mRNA水平表达各组差异无统计学意义.结论 成年大鼠心肌缺血再灌注后Caspase-3活性增高可能与XIAP表达降低有关,提示XIAP表达降低可能参与了心肌缺血再灌注诱导的细胞凋亡.

α干扰素对结肠癌细胞株lovo和sw1116中X染色体连锁凋亡抑制相关因子1表达调节作用

目的:研究α干扰素(IFN-α)对结肠癌细胞株lovo和sw1116中X染色体连锁凋亡抑制相关因子1(XAF1)表达调节作用。方法:以不同浓度(250、125、62.5和0 U/ml)的IFN-α作用细胞,荧光素酶报道系统检测IFN-α对XAF1启动子活性的影响,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质免疫印迹等方法观察IFN-α对XAF1的mRNA和蛋白表达水平的影响。结果:IFN-α可提高XAF1启动子活性,在lovo和sw1116中分别达到61.7%和87.1%(P<0.05),同时在mRNA和蛋白水平上调XAF1表达,并呈剂量依赖关系(P<0.05)。结论:IFN-α可上调XAF1表达,提示XAF1可能是干扰素刺激基因(ISG)。

黄芩苷对海人酸致痫小鼠海马X染色体连锁凋亡抑制蛋白表达的影响

目的探讨黄芩苷对海人酸诱导的小鼠癫痫持续状态后海马组织X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)表达的影响。方法将90只ICR雄性小鼠随机分为对照组、癫痫持续状态(SE)组、黄芩苷治疗组,每组30只;采用侧脑室注入海人酸建立小鼠癫痫持续状态模型。通过苏木素-伊红(HE)染色观察黄芩苷对小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞的形态学改变;应用免疫组化和Western blot方法检测小鼠海马组织中XIAP的表达量。结果黄芩苷明显改善SE后小鼠海马组织的病理形态学,海马CA3区XIAP在SE后6 h起逐渐增加,12 h达高峰,24 h有所下降;与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。黄芩苷治疗组海马XIAP蛋白表达在6 h、12 h和24 h均高于SE组(P<0.05)。结论黄芩苷对小鼠癫痫持续状态后海马神经细胞的保护作用,可能与其促进XIAP的表达有关。

CCCTC结合因子在HeLa细胞中调控X染色体连锁的凋亡抑制蛋白的表达

目的:确定HeLa细胞的CCCTC结合因子(CTCF)表达水平是否与细胞的抗凋亡能力相关,并研究其具体分子机制。方法:用顺铂和阿糖胞苷分别诱导HeLa细胞和CTCF敲降的HeLa-CTCF-II-11细胞凋亡,比较两者的凋亡率;用基因表达芯片检测CTCF敲降后HeLa细胞的表达谱变化,寻找并验证受CTCF调控的与凋亡相关的蛋白。结果:用顺铂和阿糖胞苷诱导后,HeLa-CTCF-II-11细胞的凋亡率显著高于HeLa细胞;HeLa细胞的CTCF敲降后,X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达显著下降。结论:CTCF敲降使HeLa细胞的抗凋亡能力下降,CTCF对XIAP基因的表达调控在这个过程中起了重要作用。

X染色体连锁凋亡抑制蛋白的研究进展

X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)是凋亡抑制蛋白(IAPs)家族中的重要一员,其主要由N末端3个杆状病毒IAP重复序列(BIR)和C末端一个锌指结构域组成,其主要通过与caspase相互作用抑制细胞凋亡,此外XIAP还可通过核因子κB途径和参与信号转导途径抑制细胞凋亡。XIAP的正向调节主要是在翻译过程中实现的,而负向调节则主要由Smac、转化生长因子β信号通路中的凋亡相关蛋白、HtrA、XIAP相关因子1凋亡抑制蛋白1等XIAP抑制分子实现。XIAP与肿瘤治疗研究方面,反义寡核苷酸技术、XIAP小分子抑制剂、RNA干扰技术等为治疗肿瘤提供了新的研究方向。

缺氧诱导因子-1α与X染色体连锁凋亡抑制蛋白在人卵巢癌中的表达及意义

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与X染色体连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)在人卵巢癌中的表达及意义。方法用免疫组织化学技术法检测人正常卵巢组织标本10例、良性卵巢肿瘤标本10例、交界性卵巢肿瘤标本10例及恶性卵巢癌组织标本30例中HIF-1α和XIAP的表达情况;培养人卵巢癌细胞系SKOV3,向细胞培养瓶中加入HIF-1α激动剂和抑制剂,提取细胞总RNA,用RT-PCR技术观察XIAP和HIF-1α基因表达变化。结果XIAP、HIF-1α在恶性上皮性卵巢癌组及交界性肿瘤组表达率均明显高于良性卵巢肿瘤组(P<0.05)。恶性上皮性卵巢癌组织中HIF-1α与XIAP在临床分期晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)组的阳性表达率明显高于临床分期早期(Ⅰ期和Ⅱ期)组(P<0.05),与患者年龄、病理分型和淋巴结转移无关(P>0.05)。在恶性上皮性卵巢癌中HIF-1α与XIAP呈正相关(P<0.05)。随缺氧时间延长,SKOV3细胞系中HIF-1αmRNA表达量渐增;低氧24 h时HIF-1αmRNA表达量达高峰,36 h时HIF-1αmRNA表达量有所回落;添加HIF-1α抑制剂雷帕酶素后,HIF-1αmRNA表达量明显减少,XIAPmRNA亦减少。SKOV3细胞系中XIAP mRNA随HIF-1αmRNA而变化。结论HIF-1α和XIAP可能参与了恶性卵巢肿瘤的发生;HIF-1α和XIAP的高表达可能提示预后不良;HIF-1α对XIAP可能存在调控作用,两者可能协同促进卵巢癌的发生。

虾夷马粪海胆X染色体连锁凋亡抑制蛋白XIAP基因克隆及不同病原微生物刺激后的表达响应

为研究X染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)在虾夷马粪海胆Strongylocentrotus intermedius(体质量为40~80 g)天然免疫系统中的作用,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得虾夷马粪海胆XIAP基因的cDNA序列,并通过实时定量PCR分析了其在各组织中的分布,以及经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)、强壮弧菌Vibrio fortis和葡聚糖(whole glucan particles,WGP)刺激后,XIAP基因在体腔细胞中的表达情况。结果表明:虾夷马粪海胆XIAP基因的cDNA长为4894 bp,其中,5′UTR为459 bp,开放阅读框为2331 bp,3′UTR为2104 bp,共编码776个氨基酸,具有3个BIR结构域和1个RING指环结构域,预测该蛋白相对分子质量为86960,等电点为5.96,为酸性蛋白;虾夷马粪海胆XIAP基因在检测的各组织中均有表达,其中,在卵巢中的表达量显著高于管足、体腔细胞、围口膜、肠和精巢(P<0.05);经PGN、LPS、Poly I:C、WGP和V.fortis刺激后,体腔细胞中的XIAP基因表达量显著上升(P<0.05),并在PGN、LPS和Poly I:C刺激后12 h,WGP刺激后24 h,V.fortis刺激后6 h时,XIAP基因表达量均达到最高值。研究表明,克隆获得的XIAP基因参与了虾夷马粪海胆的免疫应答,并在海胆的天然免疫中发挥重要作用。

X染色体连锁的凋亡抑制蛋白对米非司酮诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的观察X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP蛋白)对米非司酮诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响。方法 XIAP重组质粒转染HeLa细胞,共聚焦显微镜观察其在细胞内的分布;流式细胞仪检测米非司酮处理和未处理的各组细胞凋亡率。结果 XIAP在HeLa细胞中弥漫分布于细胞核和细胞浆,米非司酮可诱导HeLa细胞凋亡,XIAP能抑制由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡。结论米非司酮能促进HeLa细胞凋亡,XIAP能抑制由米非司酮诱导的HeLa细胞凋亡。

Ⅲ型β-微管蛋白、微管相关蛋白tau及凋亡抑制蛋白survivin的mRNA水平与胃癌对紫杉醇敏感性的研究

目的:探讨胃癌细胞中Ⅲ型β-微管蛋白(ClassⅢβ-tubulin)、微管相关蛋白tau(MAPT)和凋亡抑制蛋白survivin的表达水平对化疗药物紫杉醇敏感性的预测价值。方法:采用ATP生物荧光法检测54例胃癌原代细胞对紫杉醇的体外药物敏感性,RT-PCR法检测胃癌细胞内ClassⅢβ-tubulin、MAPT和survivin的mRNA表达水平,分析胃癌细胞对紫杉醇的体外敏感性与上述生物学指标表达水平的关系。结果:ClassⅢβ-tubulin的mRNA表达水平为1.04±0.22,与分化程度有关(P=0.029);MAPT的mRNA表达水平为0.80±0.17;survivin的mRNA表达水平为1.00±0.19,与分化程度有关(P=0.009)。药敏指数与ClassⅢβ-tubulin表达水平呈负相关(r=-0.372,P=0.006),与MAPT表达水平呈负相关(r=-0.292,P=0.032),与survivin表达水平呈负相关(r=-0.340,P=0.012);ClassⅢβ-tubulin与MAPT mRNA表达水平呈正相关(r=0.284,P=0.037),与survivin mRNA表达水平呈正相关(r=0.559,P=0.000)。结论:胃癌细胞中ClassⅢβ-tubulin、MAPT和survivin的表达水平可能对紫杉类药物的化疗敏感性具有较好的预测价值。

肺癌金属蛋白酶、金属蛋白酶抑制因子表达和细胞凋亡与预后的相关性

目的 :研究人肺癌组织中金属蛋白酶 ,金属蛋白酶抑制因子的表达和细胞调亡与病人预后的关系。方法 :应用免疫组化法测MMPs、TIMPs在肺癌标本中的表达、用原位杂交法 (ISH)测TIMP1mRNA、用TUNEL法测细胞凋亡。结果 :MMP2 与MT1 MMP表达十分相近 ;TIMP1 2 在Ⅲ、Ⅳ期肿瘤中强阳性表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期肿瘤 ;NSCLC术后存活 4年以下者其MMP1、MT1 MMP、MMP2 蛋白强阳性表达率和显著高于 4年以上存活者细胞凋亡指数。结论 :MMP1 2 、TIMP1 2 在肺癌组织中的表达强度与肿瘤的分期相关 ,MMP2 与MT1 MMP的表达密切相关且与病人预后有相关性 ,TIMP3的表达和细胞凋亡与病人预后有相关性。

X连锁凋亡抑制蛋白相关因子-1抑制肝癌裸鼠移植瘤生长的研究

目的研究X连锁凋亡抑制蛋白相关因子-1(XAF1)基因对人肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法建立人肝癌细胞株SMMC7721裸鼠荷瘤模型,每组5只裸鼠分别在瘤内分3点注射相同感染滴度的重组腺病毒Ad5/F35-XAF1、Ad5/F35-Null对照空病毒及等体积的磷酸缓冲液(PBS),隔天注射1次,疗程2周。每3天测量各组裸鼠移植瘤的体积,观察Ad5/F35-XAF1组移植瘤的生长与其他两组的差异。原位末端标记TUNEL法检测移植瘤细胞的凋亡,免疫组织化学法检测移植瘤中XAF1蛋白表达和微血管密度(MVD)。结果与PBS组和Ad5/F35-Null组比较,瘤内注射Ad5/F35-XAF1组裸鼠移植瘤体积、质量和MVD显著减小(P<0.05或P<0.01),而移植瘤细胞的凋亡指数和XAF1蛋白的表达率均明显增高(P<0.01)。结论腺病毒介导XAF1基因可抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长,可能与该基因诱导肝癌细胞凋亡和抑制肿瘤血管形成有关。