重组鸡痘病毒活疫苗X-gal染色空斑计数法的建立

建立了一种简易的携带LacZ基因重组鸡痘病毒（rFPV）活疫苗的X-gal染色空斑计数法。rFPV接种次代鸡胚成纤维细胞（CEF）72 h后,加2 mL/L戊二醛固定液室温固定15 min,再加500μg/mL X-gal染色液37℃过夜,倒置显微镜下直接计数蓝染空斑。染色空斑计数法的空斑数是不染色直接计数法的1.6~3.3倍。该方法在重组鸡痘病毒活疫苗研究及其工业化生产检验中具有较大的应用价值。

一种用磷酸钙法高效转染HEK293T细胞方法的建立

利用磷酸钙转染法将lacZ-pShuttle质粒导入HEK 293T细胞中,实验证明,pH值、DNA纯度、转染后培养时间和甘油休克时间是影响转染效率的重要因素。转染后培养6h进行甘油休克效果最佳,比培养0h直接进行休克转染效率升高584.4%;甘油休克时间为4.5min时转染效果最佳,比不用甘油休克转染效率升高130.8%。通过对影响转染的几个条件进行优化,建立了1种可以高效转染HEK 293T细胞的方法,且简便易行。

LacZ基因在小鼠骨骼肌中表达的时─空模式

以ＬａｃＺ为报告基因，利用ＤＮＡ重组技术构建了ＬａｃＺ真核表达质粒ｐＣＤＬａｃＺ，ｐＣＤＬａｃＺ肌注小鼠后，Ｘ－Ｇａｌ染色法及半乳糖苷酶定量分析结果表明，ＬａｃＺ基因在小鼠胫前肌中得到表达，并在肌注后第７天左右达到高峰，表达的ＬａｃＺ主要分布于胫前肌近膝关节肌腱结合处，提示肌肉接种基因疫苗应采用纵向，接种部位应接近肌腱结合处。

神经黏附分子NB-3在转基因小鼠脑的发育表达

目的检测NB-3在小鼠大脑组织中不同时期的表达情况。方法采用带LacZ基因的NB-3基因敲除的杂合子小鼠,分别取E12、E14、E16、E18、P0、P7、P14及成年小鼠的脑组织固定,采用X-gal染色方法检测LacZ基因产物β-半乳糖苷酶的表达以显示NB-3的表达及定位。结果1.NB-3在胚胎发育期间从E14开始有微弱的表达,后逐渐在侧脑室周围、皮层、丘脑、下丘脑及海马等部位表达。其中在皮层中的表达主要集中在Ⅱ/Ⅲ、Ⅴ层。2.NB-3在出生后小鼠大脑中的表达明显升高,在P7时表达最高,此后稍有下降直至成年。3.NB-3在成年小鼠大脑组织中的表达分布广泛。表达最强的部位分别是大脑皮层的II/III、V层、梨状皮层、杏仁核周皮质、丘脑、下丘脑以及海马的CA1区等。结论NB-3在发育和成体小鼠中枢神经系统中均有表达,且不同时期的表达量有所不同。提示NB-3在神经系统的发育过程中可能具有重要的作用。

基于Cre/Loxp系统Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶转基因小鼠的建立

目的采用大肠杆菌β-半乳糖酶基因LacZ作为报告基因,建立Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶含有loxp位点的转基因小鼠。与不同组织特异性Cre小鼠杂交,获得时空性表达Tyro3、Axl的转基因小鼠,为研究其在各个组织中的功能奠定基础。方法构建含有loxp位点的Tyro3、Axl受体酪氨酸激酶质粒,测序正确后,通过显微注射法将插入CAG启动子下游的Geo-STOP-msAxl及Geo-STOP-msTyro3基因的转基因载体注射入BDF1供体鼠受精卵,移植受精卵至ICR受体鼠,待产仔后,通过双引物PCR鉴定F0以及Fn代小鼠的基因型,RT-PCR,X-gal染色观察小鼠组织中LacZ基因,运用WB(Western Blot)检测转基因小鼠和野生型小鼠体内目的蛋白表达的差异。结果获得了含有目的基因的转基因阳性小鼠;通过RT-PCR对阳性小鼠证明LacZ基因的存在;对存在LacZ基因的小鼠进行X-gal染色,在Geo-STOP-msTyro3的脑、睾丸、胸腺中观察到蓝色沉淀,在Geo-STOP-msAxl的脑、心、肾中观察到蓝色沉淀,间接说明目的基因能表达的组织和器官;对双阳性的Geo-STOP-msTyro3、Geo-STOP-msAxl转基因小鼠和野生型小鼠,WB检验证实Tyro3、Axl基因的表达没有差异,说明在加入stop序列之后,Tyro3基因确实存在,而且表达受到抑制。结论成功建立Geo-STOP-msAxl及Geo-STOP-msTyro3酪氨酸受体转基因小鼠。