阿司匹林预处理对缺血再灌注豚鼠耳蜗XAF1蛋白表达的影响

目的观察阿司匹林(aspirin,ASA)预处理对豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury,IRI)后XAF1蛋白(XIAP-associated factor 1,XAF1)表达的影响。方法健康豚鼠64只,随机分成正常组、假手术组、模型组和干预组(术前腹腔注射阿司匹林注射液50mg/kg,每天一次,共7d),模型组和干预组再各分成3个亚组:IRI6h组、24h组和48h组。用HE染色法观察IRI不同时间段耳蜗各部位的形态改变,免疫组织化学法检测内耳XAF1的表达,Western blotting检测XAF1的表达量。结果正常组、假手术组耳蜗形态正常,XAF1在螺旋神经节细胞质为阳性表达;模型组耳蜗形态改变,螺旋神经节细胞XAF1阳性表达水平高于正常组、假手术组(<0.05);干预组XAF1表达水平较模型组减弱。结论阿司匹林预处理对IRI内耳的保护作用可能与下调XAF1蛋白表达相关。

XIAP和XAF1在中耳胆脂瘤中的表达及其与细胞凋亡的关系

目的:研究凋亡抑制蛋白XIAP及其拮抗蛋白XAF1在中耳胆脂瘤中的表达及胆脂瘤上皮的凋亡情况,探讨三者之间的关系及意义。方法:采用组织芯片技术结合免疫组化法检测50例胆脂瘤标本及20例正常外耳道上皮中XIAP及XAF1的表达;采用末端转移酶介导的原位缺口末端标记染色(TUNEL)技术检测两组标本的凋亡状态。结果:①胆脂瘤上皮中的XI-AP、XAF1蛋白表达显著高于正常上皮(P<0.01)。②胆脂瘤细胞凋亡显著高于正常上皮(P<0.01)。③胆脂瘤上皮中,XI-AP、XAF1二者表达呈正相关(P<0.01);XAF1表达与凋亡呈正相关(P<0.01)。结论:XIAP、XAF1在胆脂瘤中的表达同步升高,提示在胆脂瘤发病中,促凋亡与抑凋亡二者达到了新的平衡,使胆脂瘤上皮细胞过度增生但不能无限增殖。

大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatoryfactor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点。方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497～+166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用。同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1、pGL3-XAF1-2、pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)。将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功。将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加。而将pGL3-XAF1-QC、pGL3-XAF1(1～4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2。提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337～-47 nt区域。结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础。